抗纖靈對55//66腎切除誘導慢性腎臟纖維化小鼠模型細胞外基質的影響

麻志恒，鐘利平，余柯娜，何立群上海中醫藥大學附屬曙光醫院腎病科，上海003；上海交通大學醫學院附屬新華醫院崇明分院，上海050

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抗纖靈對55//66腎切除誘導慢性腎臟纖維化小鼠模型細胞外基質的影響

麻志恒1, 2，鐘利平1，余柯娜1，何立群11上海中醫藥大學附屬曙光醫院腎病科，上海201203；2上海交通大學醫學院附屬新華醫院崇明分院，上海202150

摘要：目的探討抗纖靈對5/6腎切除誘導的慢性腎臟纖維化小鼠模型腎組織細胞外基質（ECM）的影響。方法C57BL/6J雄性小鼠，采用5/6腎切除制備慢性腎臟纖維化模型，2周后根據肌酐水平把手術組小鼠分為模型組，雷帕霉素和抗纖靈組，同時設立假手術組，每組10只，雷帕霉素，抗纖靈組分別給予雷帕霉素（0.00 016 g/kg），抗纖靈（0.4 g/（kg·d）灌胃治療，模型組和假手術組等量蒸餾水，連續用藥4周后處死小鼠，免疫熒光法測定腎組織I型膠原（ColⅠ），Ⅲ型膠原（ColⅢ），α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）纖維化面積；RT-PCR法檢測腎組中，ColI，ColⅢ，α-SMAmRNA的表達。結果與假手組比較，模型組ColI，ColⅢ，α-SMA膠原纖維化面積比值明顯增加，ColI，ColⅢ，α-SMAmRNA顯著增高（P<0.01），與模型組比較，雷帕霉素，抗纖靈組膠原纖維面積比值，mRNA表達水平均有所降低（P<0.01）。雷帕霉素與抗纖靈組比較，兩者之間無顯著性差異。結論抗纖靈具有雷帕霉素類似的作用，能夠通過抑制小鼠腎組織ColI，ColⅢ，α-SMAmRNA的表達，減少ColI，ColⅢ，α-SMA纖維化面積，對腎纖維化有一定的改善作用。

關鍵詞:抗纖靈；慢性腎纖維化；細胞外基質；I型膠原；Ⅲ型膠原；α-平滑肌肌動蛋白

腎間質纖維化是引起慢性腎衰的主要因素之一，而引起腎間質纖維化的原因主要包括各種細胞因子，生長因子等導致的炎癥反應，細胞增殖等，另一條主要的原因就是腎組織細胞外基質（ECM）的沉積［1］。ECM主要包括膠原蛋白，纖連蛋白，蛋白多糖以及糖蛋白，均由腎小球固有細胞所分泌，正常情況下其生成和降解處于動態平衡中，在許多因子如轉化生長因子，炎癥因子等作用下，其動態平衡被打破，最終導致ECM的沉積，進而引起腎間質纖維化。

研究表明激活mTOR信號通路能夠激活巨噬細胞和肌成纖維細胞，加重纖維化的形成［2-4］，而使用雷帕霉素能夠抑制mTOR通絡，可以明顯減腎間質的炎癥和纖維化，延緩腎功能喪失［5-8］。我們的前期研究表明抗纖靈能夠通過抑制TGF-β1/Smad信號通路，改善大鼠腎衰模型腎臟的纖維化［9-13］，但抗纖靈是否能夠通過mTOR信號通絡，減輕腎衰模型小鼠腎組織的ECM，本文做了進一步探索。

1　材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1動物清潔級C57BL/6J小鼠40只，體質量為18~ 22 g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供（許可證號：SCXK(滬)2008-0016）。小鼠分籠飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心，予12 h光照，45℃濕度的環境中，自由飲水，進食標準普通飼料，適應性喂養1周后進行實驗。

1.1.2藥物由丹參15 g，桃仁12 g，當歸12 g，懷牛膝15 g，酒大黃9 g組成，由上海曙光醫院中藥房提供，藥材經生藥學專家鑒定，保存樣品備查，按傳統方式加水煎煮制備水煎液。滅菌后-20℃保存備用。雷帕霉素粉劑10 mg，購自上海威奧生物，批號：R706203，分別按照0.4 g/kg，0.0016 g/kg，0.5 mL/d/只小鼠配成溶液。1.1.3主要試劑磁珠法RNA抽提試劑盒購自TOYOBO；逆轉錄試劑盒：Prime Script RT reagent Kit （TaKara）；SYBR Premix Ex Taq（TaKara），兔抗鼠ColI，ColⅢ，α-SMA抗體,單克隆羊抗兔熒光抗體（美國Cell Signaling）。

1.1.4主要儀器5417R型高速低溫離心機（德國Eppendorf），ELX800型酶標儀（美國Bio-Tek），Mini Protean Cell小型垂直電泳電泳槽（美國Bio-Rad），CFX-96熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad）。Nano Vue TM-plus核酸蛋白測定儀（美國GE healthcare）。

1.2方法

1.2.1 5/6腎切除誘導的慢性腎臟纖維化模型的建立（Platt法）以3%戊巴比妥鈉按40 mg/kg劑量腹腔注射麻醉，小鼠俯臥位暴露左腎區，在距左脊肋骨1.5 cm處做斜向外的切口，經后腹膜取出左腎，并暴露于外，剝離腎周脂肪及包膜后，弧形切除2/3腎組織（主要切除皮質部分），消毒棉球壓迫止血，觀察切面無活動性出血后復位剩余左腎，然后逐層縫合腹膜、肌肉及皮膚，7 d后以相同的方法麻醉小鼠，完全游離右腎腎蒂后結扎，行右腎摘除，然后逐層縫合腹膜、肌肉及皮膚。2次手術共切除腎臟約80%。假手術組僅在手術時作背部切口，打開腎區皮膚肌肉并暴露腎臟后再縫合傷口。

實驗分組及給藥：40只小鼠隨機選取10只作為假手術組，其余為手術組，按以上方法制作慢性腎衰模型。2周后采用小鼠眼內眥取血，測血肌酐水平。將模型成功小鼠按血肌酐水平分為模型組（10只），雷帕霉素組（10只）、抗纖靈組（10只）、使各組之間的血肌酐值無統計學差異（P>0.05）。雷帕霉素，抗纖靈組分別給予雷帕霉素（0.0016 g/kg），抗纖靈（0.4 g/kg）各0.5 mL/d灌胃治療，模型組和假手術組等量蒸餾水，連續用藥4周。1.2.2實驗標本收集及指標檢測方法處死前1 d禁水6 h，以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，摘取左側殘腎，用生理鹽水沖洗，冰上操作，除去血污及脂肪等組織，腎臟組織一部分甲醛固定，行免疫熒光染色，并計算纖維化面積，另一部分入冷存管，存放于液氮罐中，運用RT-PCR法檢測腎臟組織中ColI，ColⅢ，α-SMAmRNA的表達。

1.2.3免疫熒光染色及觀察膠原纖維面積比值每組隨機選取6個標本作為觀察對象，每個標本取9張切片，分別用于ColI，ColⅢ，α-SMA免疫熒光染色，具體步驟為：取腎組織4 μm常規石蠟切片脫蠟至水，抗原修復，0.4%胃蛋白酶消化30 min，10%正常羊血清封閉10 min，經PBS，10 min/次，3次洗滌后分別加入兔抗鼠ColI，ColⅢ，α-SMA抗體（1∶300），4℃孵育過夜；次日PBS15 min/次，洗滌3次后滴加單克隆的羊抗兔熒光抗體（1∶200, ALexa488），室溫下搖床2 h（避光），PBS15 min/次，洗滌3次后（避光）加DAPI，抗衰變封片劑（聚乙烯醇-緩沖甘油混合介質）封片，日本LEICA-TCSSP2型激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察，雙通道掃描采集圖像，通過雙通道熒光集成圖像觀察腎組織中的ColI，ColⅢ，α-SMA表達表達。

計算機圖象半定量分析：所有經免疫熒光染色的切片均于實驗結束時由操作人員在單盲情況下逐一在顯微鏡下讀片，每例切片平均選取5個不同視野，應用LEICA多功能真彩色病理圖象分析系統進行圖像分析，測定纖維化陽性染色面積占整個視野面積的比值、即陽性面積率，取其平均值作為該切片纖維化面積的測定值。

1.2.4 RT-PCR法測定ColI，ColⅢ，α-SMAmRNA的表達實驗前所有器具去RNA酶處理，取-80℃保存的小鼠腎組織100 mg，提取總RNA，選取OD260/OD280均在1.8~2.0的樣本進入下一輪反轉錄反應。應用Real-time PCR Master Mix的方法進行Real- time PCR。以GAPDH為內參對照。引物序列：ColI：上游引物5'-AGCCAGTCGCATCAGGAACC-3'，下游引物5'-GGGAGCATCATCAC -3'；擴增片段長度175 bp；ColII：上游引物5'-AGATGCTGGTGCTGAGAAG -3'，下游引物5'-TGGAAGAAAGTCTGAGGAAGG -3'，擴增片段長度134 bp；α-SMA：上游引物5'-AAGAGGAAGACAGCACAECTC-3'，下游引物5'-GATGGATGGGAAAACAGCC-3'，擴增片段長250 bp; GAPDH:上游引物5'-GCTCGCTGTGAACGGATTTG-3'，下游引物5'-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3'，擴增片段長度309 bp，上述引物均由上海生工生物技術公司合成。PCR反應體系20μL，蒸餾水6.8μL，cDNA 2μL，上、下游引物各0.4μL，ROX Reference Dye 0.4μL，PCRMix 10μL。反應條件采用二步法：95℃30 s預變性；95℃5 s，60℃30 s，40個循環。數據采用StepOne Software V2.1計算分析。

1.3統計學處理

應用SPSS13.0軟件進行處理，計量資料用均數±標準差表示，組間均數比較采用單因素方差分析（ANOVA）。

2　結果

2.1抗纖靈對各組小鼠腎組織ColI，ColⅢ，α-SMA表達的影響

光鏡下觀察，免疫熒光染色結果顯示：假手術腎組織中ColI，ColⅢ，α-SMA熒光表達較少，模型組中有較多的膠原纖維沉積，雷帕霉素，抗纖靈組膠原纖維的面積與模型組比較明顯減少（圖1~3）。

2.2抗纖靈對各組小鼠腎組織ColI，ColⅢ，α-SMA相對熒光面積比值影響的比較

使用圖像處理系統測量膠原纖維陽性區占所觀察視野的面積比，結果發現，與假手術組比較，模型組熒光面積比例明顯增加（P<0.01），與模型組比較，雷帕霉素，抗纖靈組熒光面積比例明顯下降（P<0.01），但兩治療組之間比較，沒有顯著性差異（P>0.05，表1）。

表1　各組小鼠腎組織ColⅡ，ColⅢ，α-SMA相對熒光面積比較（n=6）

2.3各組小鼠腎組織ColI，ColⅢ，α-SMAmRNA相對表達量的比較

與假手術組相比，模型組ColI，ColⅢ，α-SMA表達量顯著升高（P<0.01），與模型組相比，雷帕霉素，抗纖靈組ColI，ColⅢ，α-SMAmRNA表達量顯著下調（P< 0.01），雷帕霉素與抗纖靈比較，兩者之間無顯著性差異（P>0.05，表2）。

表2　各組腎組織ColⅡ，ColⅢ，α-SMAmRNA相對表達量比較

3　討論

ECM是細胞骨架的延伸，其能夠影響細胞的生長，發育與死亡，可以決定細胞的形狀，控制細胞的分化，參與細胞的轉移，細胞通過ECM的黏附作用而產生的力能夠動態地感知周圍環境的變化［14］，在炎癥，免疫反應，毒素等因素的刺激下，間質成纖維細胞被激活，出現增殖和表型改變，表達α-SMA蛋白，分化為肌成纖維細胞，主要合成和分泌Ⅰ，Ⅲ型膠原，加劇了ECM的聚集［15-16］。積聚的ECM一方面突入腎小球毛細血管壁，導致管壁增厚，管腔狹窄，另一方面積聚在腎小球內，導致腎小球硬化，造成腎臟功能進行性損害［17-18］。

mTOR通過調節其下游的信號分子如S6 kinase （S6k）和4E-binding protein-1（4EBP-1）等，對細胞的生長，繁殖，增生等起著重要的作用［19］。研究表明，通過調節mTOR的活性，能夠調控膠原蛋白，纖連蛋白等ECM的合成和分泌［20］,而mTOR抑制劑,則在許多組織纖維化疾病中具有很好的抗纖維化作用［21-24］。

可見，尋找防止細胞的增殖并阻斷其分泌ECM的因素對防治腎臟疾病的發生和發展，延緩腎功能惡化具有重要的臨床意義。本實驗中，我們使用5/6腎切導致腎臟纖維化模型，采用雷帕霉素為對照藥，擬從mTOR通路入手，觀察抗纖靈對小鼠腎組織ECM的影響，結果表明，抗纖靈能夠明顯減少模型小鼠腎組織纖維化的面積，抑制ColI，ColⅢ，α-SMA基因的表達，療效和雷帕霉素相似，因此我們推測，抗纖靈可能通過mTOR信號通路，或者至少參與了mTOR信號通路的調節，減輕腎臟的損害。

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綜述

Effects of kangxianlin on Extra cellular Matrix Depodition in 5/6 nephrectomized inducedchronic renal failure mice kidney tissue

MA Zhiheng1, 2, ZHONG Liping1, YU kena1, He liqun11Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203 ,China;2Xinhua hospital chongming branch affiliated to Shanghai jiaotong university school of medicine, Shanghai 202150, China

Abstract:Objective To determine effects of Kangxianling decoction (KXLD) on Extracellular Matrix (ECM) Depodition in 5/6 nephrectomized-induced chronic renal failure mice kidney tissue. Methods SPF C57BL/6J male mice weighing18-22g, divided into sham group and surgrey group，establish an model of chronic renal failure caused by 5/6 nephrectomized . Two weeks later after surgrey, according to serum creatinine(Scr) level, the mices were divided into model group, KXLD and rapamycin (RAP) group, so Scr level between the surgrey groups was no significant difference(P>0.05). KXLD and RAP were gavaged respectively according to 0.4 g/kg 0.00016 g/kg/day. sham and model group are the same amount of distilled water. After 4 weeks of treatment, Collagen area and mRNA expression of Collagen Type I(ColI)，Collagen TypeⅢ(ColⅢ）,α-smooth muscle actin,(α-SMA）were Observed by immunofluorescence and real-time PCR method. Results Compared with sham group, the levels Collagen area and mRNA expression of ColI, CoⅢ,α-SMA increased significantly in the model group(P<0.01), Compared with model group, the levels Collagen area and mRNA expression of ColI，ColⅢ,α-SMA decreased significantly in the KXLD and RAP group (P<0.01).Compared with KXLD and RAP, there have no different (P>0.05). Conclusion KXLD is able to decreased the level of Collagen area ,inhibited mRNAexpression of ColI, ColⅢ,α-SMAand have the similar effection as RAP. Key word: Kangxianling decoction; chronic renal fibrosis; ECM; ColI; ColⅢ;α-SMA

通信作者：何立群，E-mail: zhiheng_macm@163.com

作者簡介：麻志恒，E-mail: zhiheng_macm@163.com

基金項目：國家自然基金面上項目（81373615）；國家臨床重點?？平ㄔO；國家中醫藥管理局重點?？平ㄔO

收稿日期：2015-11-15