重癥肌無力相關抗體研究進展

李若冰,馬琪林

(1. 廈門大學醫學院 神經內科,福建 廈門,361000;2. 廈門大學附屬第一醫院 神經內科,福建 廈門,361000)

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重癥肌無力相關抗體研究進展

李若冰1,馬琪林2

(1. 廈門大學醫學院 神經內科,福建 廈門,361000;2. 廈門大學附屬第一醫院 神經內科,福建 廈門,361000)

重癥肌無力; 抗乙酰膽堿受體抗體; 肌肉特異性酪氨酸激酶抗體; 低密度脂蛋白受體相關蛋白4抗體;低親和力AChR抗體; 乙酰膽堿酯酶相關聯膠原蛋白抗體; 聚蛋白抗體

重癥肌無力(MG)是一種神經肌肉接頭傳遞障礙疾病。1973年Patrick和Lindstrom發現了抗乙酰膽堿受體抗體是導致MG的自身抗體。2000年Hoch等發現了除AChR抗體以外的新抗體肌肉特異性酪氨酸激酶抗體，隨后2011及2012年低密度脂蛋白受體相關蛋白4抗體也在一部分患者中被檢測到。隨著檢驗細胞檢測技術的不斷提高，研究人員也陸續在患者血清細胞的表面發現了低親和力AChR抗體和乙酰膽堿酯酶相關聯膠原蛋白抗體。本文對近年來新發現的MG相關抗體做一綜述。

1 神經肌肉接頭(NMJ)結構及信號傳導

1.1 神經肌接頭的結構

神經肌肉接頭主要由運動神經軸突末端杵狀膨大形成突觸前膜，胞膜內陷形成皺褶。前膜與后膜間為突觸間隙約為20～40 nm。運動神經軸突末端的軸漿內聚集了大量乙酰膽堿囊泡，突觸前膜上分布有電壓門控鈣離子通道。突觸后膜表面匯聚乙酰膽堿受體，其他還有與乙酰膽堿受體(AChR)功能相關的蛋白質，如MuSK、Rapsyn、LRP4,這些蛋白分布具有高度空間特異性。目前認為MG與Agrin-LRP4-MuSK和Wnt信號通路介導的乙酰膽堿受體發育、聚集及穩定維持有關。

1.2 Agrin-LRP4-MuSK信號對AChR聚集和穩定維持的調節

MuSK信號在AChR聚集中的作用是十分明顯的。MuSK是受體酪氨酸激酶超家族中的一員，有細胞外配體綁定區，跨膜區及細胞內激酶區，需要配體結合后二聚化，誘導激酶區相互自磷酸化而被激活。聚集蛋白(Agrin)誘導MuSK激活后含有磷酸酪氨酸綁定結構域的船塢蛋-7(Dok7)綁定于MuSK,腫瘤成蟲盤1在MuSK和締合蛋白之間架起了橋梁。另外MuSK外功能區含有免疫球蛋白樣結構和半胱氨酸富集區域,Ig1/2負責Agrin-Lrp4-MuSK信號誘導的AChR聚集。最新研究[1]提示MuSK對神經型AChR簇及非神經型AChR簇的形成均起著重要的組織作用，而且參與了突觸前膜的分化。LRP4在AChR聚集中起到了關鍵性的作用，盡管agrin和MuSK對NMJ的形成起著關鍵性作用，但是agrin不能誘導MuSK-/-肌細胞神經型AChR簇形成，提示這兩者并不直接相互作用。Glass等[2]認為可能有一種元件作為agrin與MuSK橋梁分子。隨后研究顯示,NMJ的發育需要LRP4參與，其作用為agrin在肌管直接綁定LRP4后聚集于NMJ,這揭示 LRP4是agrin的共受體,agrin誘導MuSK激活導致AChR聚集需要LRP4的參與。

1.3 Wnts與agrin共同調節AChR聚集和穩定

Wnt是一類分泌型糖蛋白,Wnt在細胞增殖與分化、凋亡、腫瘤發生、NMJ形成及突觸分化中起重要調節作用。Wnt主要的信號途徑有Wnt綁定到卷曲蛋白受體和LRP5/6,募集蓬亂蛋白(Dvl1),軸蛋白復合體，糖原合成酶激酶3β集聚于胞質[3]。Jing等[4]的酵母雙雜交篩選實驗證實agrin介導的AChR聚集需要Dvl1的參與。Agrin激活PAK1需要Dvl1的存在,MuSK、Dv1、PAK1形成三聚體對AChR聚集起著關鍵性作用，而Dvl1是Wnt信號通路中的支架蛋白。另外結腸腺瘤樣息肉蛋白是經典Wnt信號途徑中的重要調節因子，與微管，肌動蛋白相互作用[5]。最近報道8種Wnts能綁定MuSK外域[6]，這提示Wnts結合部位的多樣性，在調節AChR發育、聚集、維持穩定起多重作用。另有研究[7]表明Wnt信號通路對AChR聚集和穩定還有負性調節作用如最近有報道nt7a,Wnt8a和Wnt10b也能抑制agrin誘導的AChR聚集。

2 重癥肌無力相關抗體研究

2.1 AChR-Ab

AChR-Ab被認為是導致MG的主要抗體,MG患者的AChR-Ab陽性率為80～85%[8],在全身型和早發性MG患者血清中AChR-Ab陽性率約為90%,合并胸腺瘤的MG患者陽性率幾乎達到100%,單純眼肌型患者陽性率約為50%，治療時首先使用乙酰膽堿酯酶抑制劑。用鼠源性AChR的α亞基肽段免疫實驗動物可致實驗性自身免疫性MG動物模型，在制成模型后給予實驗動物免疫耐受處理發現免疫耐受組小鼠癥狀減輕[9]，從而證明AChR-Ab是導致MG的病因。因此檢測血清AChR-Ab被認為是MG的診斷和研究指標。有研究[10]表明AChR-Ab的滴度與疾病的嚴重程度無明顯相關。

2.2 MuSK-Ab

MuSK是選擇性表達于骨骼肌和電鰩電器官的一種跨膜蛋白，相對分子質量約110 000。MuSK是聚集蛋白的受體之一，它與聚集蛋白的共同作用可以促使AChR的聚集以及乙酰膽堿磷酸化。MuSK-Ab與MuSK的胞外區結合可以減少這種聚集。在自身免疫性重癥肌無力動物模型中[11]也證實MuSK-Ab可以明顯的阻斷肌聯蛋白依賴和非依賴途徑觸發的AChR聚集。MuSK-Ab與MuSK的結合可以加速后者的降解或直接抑制后者功能使得NMJ超微結構破壞，進而導致AChR的信號輸出減少，肌細胞動作電位閾值增加最終出現MG癥狀。血清陰性MG(SNMG)中MuSK抗體陽性率有20～50%,多發生于年輕女性。通過對中國臺灣地區的MG患者血清MUSK-Ab的研究[12]發現，相對于高加索人群SNMG患者中40～70%的陽性率，其陽性率僅為11.4%,推測MuSK-Ab的陽性率與地區及種族有關。湖北地區SNMG中MuSK-Ab陽性率低于2.5%[13]。MuSK-Ab陽性MG患者為全身型MG,受累肌肉主要有延髓肌，頸肩部肌肉，容易出現呼吸危象[14]。有研究[15]表明在野生型成年小鼠的不同部位肌肉NMJ的MuSK表達水平不同，猜測MuSK-Ab對不同部位NMJ影響程度也不同。經調查接受胸腺切除的患者并未從手術中獲益，因此胸腺切除是否適合MuSK-MG還不明確[16]。MuSK-MG患者病情嚴重程度與血清MuSK-Ab滴度有關[17]。重復神經電刺激(RNS)檢查包括面部肌肉時,MuSK-MG的RNS異常率將明顯提高[18]。堿酯酶抑制劑對MuSK-Ab陽性MG患者作用差，但對血漿置換及多種免疫抑制劑治療反應良好。

2.3 LRP4-Ab

LRP4是低密度脂蛋白受體家族中的一員。LRP4可以在老鼠體內多種組織中表達，并在胚胎期的肢體、肺等的發育中發揮重要作用。在成人骨骼肌LRP4由NMJ后膜下的肌核表達并在NMJ聚集。LRP4與集聚蛋白結合激活MuSK引起細胞內的信號級聯反應從而導致AChR的聚集。有將近20%的AChR-Ab和MuSK-Ab均為陰性的患者血清中發現LRP4-Ab。國外研究發現LRP4-Ab主要是由IgGl亞群組成，而IgGl為補體激動劑，推測LRP4介導的免疫損害可能有補體的參與。其臨床表現主要為床表現為嚴重的四肢無力或進行性延髓性麻痹，病情中等，一般未發現胸腺瘤，通常發生于年輕女性。

2.4 低親和力AChR抗體陽性MG

研究顯示一些SNMG患者臨床特點及胸腺病理表現與AChR-MG患者相似，猜測這類MG患者血清中應該存在可與AChR結合的自身抗體，但這類抗體不能被目前常規的檢測AChR-Ab的放射免疫沉淀法所檢測到。其原因可能為該方法所用的可溶AChR缺乏某些抗原決定簇或者SNMG患者血清中的自身抗體不能與這些可溶AChR有效結合。Leite[19]通過將AChR與締合蛋白的DNA共轉染到人胚腎293細胞膜上的方法檢測到低親和力AChR-Ab,發現這些抗體似乎并非作用與AChR的乙酰膽堿結合位點。另外低親和力AChR抗體陽性患者主要表現為四肢肌肉受累為主，病情嚴重程度更接近與AChR-MG,這些患者低親和力AChR-Ab主要由IgG1組成并能激活補體。另治療上乙酰膽堿酯酶抑制劑及免疫抑制劑均可使該類MG患者癥狀改善。

2.5 CoLQ-Ab

人乙酰膽堿(AChE)主要分布于神經組織如腦白質和灰質、脊髓、神經節內的神經細胞和神經肌接頭，還分布于紅細胞、血小板巨噬細胞和血清等非神經組織中。AChE降解嚴格依賴于正常的膽堿脂酶和乙酰膽堿酯酶相關膠原蛋白(CoLQ)膠原鏈，而膠原結構區域的一端與酶活性中心相連，另一端結合在細胞膜上的錨定蛋白上。AChE亞單位與錨定蛋白的協調表達決定了其分子形式及酶的定位和功能[21],CoLQ在基底膜上錨定AChE復合體，有報道稱其與MuSK相互作用[22]，但他們是怎樣干擾AChR聚集的目前仍不清楚。由于CoLQ是一種分泌蛋白,Cossins通過接觸蛋白相關蛋白2的羧基端的跨膜區域新建DNA來表達CoLQ,通過這種方式HEK293細胞被轉染了這種沒有分泌功能但能綁定在細胞膜上的CoLQ,從而通過細胞相關分析試驗檢測到在血清陽性和SNMG中都發現了針對CoLQ的抗體。

2.6 聚蛋白抗體

聚蛋白的作用能使體外培養肌細胞膜上的AChR聚集，在神經肌接頭處的作用為誘導MuSK激活后磷酸化，含有磷酸酪氨酸綁定結構域的Dok7綁定與MuSK后在誘導AChR亞基酪氨酸磷酸化，以便締合蛋白與AChR亞基作用使AChR錨定在突觸區。LRP4在傳遞過程中起到共受體作用成為Agrin與MuSK的橋梁分子。Agrin誘導MuSK激活導致AChR聚集需要LRP4的參與[23-25]。Agrin誘導AChR聚集的潛在機制主要有: ① Agrin激活酪氨酸激酶，酪氨酸激酶與MuSK相互影響酪氨酸磷酸化并形成復合物后導致肌管細胞內信號級聯放大，誘導AChR簇的移動聚集與NMJ的形成，這暗示在Agrin誘導的肌細胞中其參與AChR的重新分布和錨定。② Agrin可以增強締合蛋白熱休克蛋白90β相互作用，阻止締合蛋白在突觸區的降解，因締合蛋白對于AChR的穩定和聚集起著重要的作用。③ Agrin誘導AChR與結腸腺瘤樣息肉蛋白相作用，APC幫助AChR從而聚集[26-27]。④ 細胞周期蛋白依賴激酶5對AChR的聚集起到負性調節作用，在CDK5缺乏時AChR簇的數量和大小明顯增多。而CDK5的激活需要鈣蛋白酶,Agrin可增強締合蛋白與鈣蛋白酶相互作用從而抵抗AChR簇的離散。Cossins的研究通過運用與檢測CoLQ同樣的方法發現了針對Agrin的抗體，目前關于這種類型的MG患者的臨床表現及治療方法未有進一步研究。

[1] Lin W,Burgess R W,Dominguez B,et al. Distinct roles of nerve and muscle in postsynaptic differentiation of the neuromuscular synapse[J]. Nature,2001,410(6832): 1057-1064.

[2] Glass D J,Bowen D C,Stitt T N,et al. Agrinactsviaa MuSK receptor complex[J]. Celt,1996,85(4): 513-523.

[3] Speese S D,Budnik V. Wnts: up-and-coming at the synapse[J]. Trends in Neurosciences,2007,30(6): 268-75.

[4] Jing L,Lefebvre J L,Gordon L R,et al. Wnt Signals Organize Synaptic Prepattern and Axon Guidance through the Zebrafish unplugged/MuSKReceptor[J]. Neuron,2009,61(5): 721-733.

[5] Moseley J B,Francesca B,Kyoko O,et al. Regulated binding of adenomatous polyposis coli protein to actin. [J]. Journal of Biological Chemistry,2007,282(17): 12661-12668.

[6] LRP4 Briefs U,Kjaer J,Rigal J L. Wnt4 Participates in the Formation of Vertebrate Neuromuscular Junction[J]. J archit plann,2012,7(1): 235-238.

[7] Barik A,Zhang B,Sohal G S,et al. Crosstalk between Agrin and Wnt signaling pathways in development of vertebrate neuromuscular junction[J]. Developmental Neurobiology,2014,74(8): 828-838.

[8] Masuda T,Motomura M,Utsugisawa K,et al. Antibodies against the main immunogenic region of the acetylcholine receptor correlate with disease severity in myasthenia gravis[J]. Journal of Neurology Neurosurgery & Psychiatry,2012,83(9): 935-940.

[9] 吳懷國,楊毅,熊小平,等. 鼠源性乙酰膽堿受體α亞基97-116肽段(V108A)鼻黏膜耐受對實驗性自身免疫性重癥肌無力大鼠的影響[J]. 中華神經科雜志,2008,41(2): 110-113.

[10] 李延峰,李永紅,管宇宙,等. 重癥肌無力相關抗體的臨床意義[J]. 中華神經科雜志,2007(1): 27-30.

[11] Kazuhiro S,Sachiho K,Naoki M,et al. Induction of myasthenia by immunization against muscle-specific kinase[J]. Journal of Clinical Investigation,2006,116(4): 1016-1024.

[12] Huang Y C,Yeh J H,Chiu H C,et al. Clinical Characteristics of MuSK Antibody-positive Myasthenia Gravis in Taiwan[J]. Journal of the Formosan Medical Association,2008,107(7): 572-575.

[13] Xiaofan Z,Mingshan Y,Jinzhi X,et al. Clinical and serological study of myasthenia gravis in HuBei Province,China[J]. Journal of Neurology Neurosurgery & Psychiatry,2007,78(4): 386-390.

[14] 范欣,楊麗,楊春生,等. 肌肉特異性受體酪氨酸激酶抗體陽性重癥肌無力[J]. 中華神經科雜志,2010,43(11): 770-773.

[15] Punga A R,Maj M,Lin S,et al. MuSK levels differ between adult skeletal muscles and influence postsynaptic plasticity[J]. European Journal of Neuroscience,2011,33(5): 890-8.

[16] Amelia E,Tonali P A,Luca P,et al. Clinical correlates with anti-MuSK antibodies in generalized seronegative myasthenia gravis[J]. Brain A Journal of Neurology,2003,126(Pt10): 2304-2311.

[17] Ohta K,Shigemoto K,Fujinami A,et a1. Clinical and experimental features of MuSKanti body positive MG in Japan[J]. European Journal of Neuroscience,2012,33(5): 390-7.

[18] Oh S J,Hatanaka Y,Hemmi S,et al. Repetitive nerve stimulation of facial muscles in MuSK antibody positive myasthenia gravis[J]. Muscle & Nerve,2006,33(4): 500-4.

[19] Leite M,Jacob S S,Cossins J,et al. IgG1 antibodies to acetylcholine receptors in′seronegative′myasthenia gravis[J]. Brain A Journal of Neurology,2008,131(Pt7): 1940-1952.

[20] Judith C,Katsiaryna B,Katarzyna Z,et al. The search for new antigenic targets in myasthenia gravis[J]. Annals of the New York Academy of Sciences,2012,1275(1): 123-8.

[21] Liu Q C,Zhuang Z H,Zeng K,et al. Prevalence of Pancreatic Diabetes in Patients Carrying Mutations or Polymorphisms of the PRSS1 Gene in the Han Population[J]. Diabetes Technology & Therapeutics,2009,11(12): 799-804.

[22] Annie C,Laure S,Manuel G,et al. MuSK is required for anchoring acetylcholinesteraseat the neuromuscular junction[J]. Journal of Cell Biology,2004,165(4): 505-515.

[23] 沈展,畢明慧,吳濤. 胸腺瘤組織學分型與重癥肌無力關系的研究進展[J]. 實用臨床醫藥雜志,2015,19(5): 157-160.

[24] 王洪峰,董理,王婷婷. “溫陽補氣”針法對實驗性自身免疫性重癥肌無力大鼠血清 AchR-Ab 和IFN-γ 表達水平的影響及其作用機制[J]. 吉林大學學報: 醫學版,2014(1): 31-34.

[25] 麥衛華,韓蓉蓉,胡學強,等. 重癥肌無力合并甲狀腺功能亢進外周血T淋巴細胞Fas表達研究[J]. 中國實用內科雜志,2012,32(5): 360-362.

[26] 沙鵬,韓琦,王云甫. 自身免疫性重癥肌無力患者選擇他汀類藥物輔助間充質干細胞輸注治療的效果[J]. 中華全科醫學,2016,14(7): 1098-1100.

[27] 曾彥,羅一峰,胡丹丹. 重復神經電刺激及疲勞試驗對于全身型重癥肌無力的診斷價值[J]. 華南國防醫學雜志,2015(1): 11-13.

2016-03-18

福建省自然科學基金項目(2015J01544); 福建省醫藥衛生科技創新項目(2014-CXB-33);

馬琪林

R 746.1

A

1672-2353(2016)21-224-03

10.7619/jcmp.201621092

廈門市重要重大疾病聯合攻關項目(3502Z20149028)