重組人β防御素 2工程菌的發酵及純化研究

張　艷,?！⊙?魏洪濤*,張國利

(1. 吉林大學中日聯誼醫院 口腔科, 吉林 長春130033；2.軍事醫學科學院11所)

?

重組人β防御素 2工程菌的發酵及純化研究

張艷1,桑雪1,魏洪濤1*,張國利2

(1. 吉林大學中日聯誼醫院 口腔科, 吉林 長春130033；2.軍事醫學科學院11所)

摘要：目的發酵并純化重組人β-防御素2(HBD2)，為其生物活性的檢定奠定基礎。方法利用罐發酵人β-防御素2工程菌，并建立重組人β-防御素2的層析純化工藝。結果確定了工程菌優化的最佳發酵條件為高溶氧、低溫誘導策略，獲得了高密度發酵工藝。建立了重組人β-防御素2的特殊純化工藝。結論完成了重組人β-防御素2的發酵和純化工藝研究。

關鍵詞：人β防御素2；工程菌；融合蛋白；發酵；蛋白純化

(ChinJLabDiagn,2016,20:0362)

人β防御素(HBD)是具有廣泛抑菌作用的多肽[1,2],本實驗成功構建了BL21(λDE3) TrX-B plysS/pET32a/ TrX-A-HBD2[3]并進行了罐裝發酵培養[4]；建立了人β防御素2融合蛋白制備工藝,獲得的HBD2結構與原蛋白質結構一致[5]。為人β防御素2重組蛋白實際應用提供材料及佐證。

1材料與方法

1.1材料

原核細胞培養罐(上海保興)，重組人β防御素 2工程菌(本課題組制備)[1,3]，離心機(貝克曼庫爾特)，層析設備及介質(通用公司)，培養基和誘導劑(奧克斯德)，分析純化學試劑(國產)，腸激酶 (西格瑪)。

1.2方法

1.2.1菌種準備將凍存的重組人β防御素 2工程菌復蘇，挑單菌，接種于5 ml液體培養基中，經2次對數生長期轉接放大備用。

1.2.2罐培養原核細胞培養罐在位消毒后，調整pH值至7.2，罐溫37℃后接種，通過調節攪拌轉速和通氣量維持溶氧在25%左右，發酵進行到OD值≈10時，降低溫度至32℃，加入終濃度為1.2 mmol/L的IPTG進行誘導， 6 h后終止發酵并低溫離心收集菌體。

1.2.3細菌裂解及鹽析細菌裂解采用加入少許硫酸鏈霉素的凍融方法，細菌充分裂解后離心去除固形物，上清加入固體硫酸銨進行分步鹽析。

1.2.4人β防御素 2的粗純化20%-45%飽和硫酸銨分步沉淀的蛋白組分利用含0.5M NaCl 的Tris-Cl緩沖液重懸后，進行Cu-IMAC階段層析純化，收集100-200 mM咪唑洗脫部分。

1.2.5人β防御素 2精純化利用50 mmol/L Tris-Cl，pH7.5緩沖液平衡G-25層析柱進行樣品脫鹽，通過測定濃度和體積，計算蛋白質總量，按照50∶1的比率加入腸激酶，于37℃作用3 h，酶切產物再經過金屬螯合層析，收集流川峰，即獲得HBD2目的蛋白。

2結果

2.1工程菌經過多次罐培養優化后，獲得最優罐培養參數：pH7.2，DO為28%，32℃低溫長時間誘導，穩定產率為20 g菌體/L左右。

2.2IMAC層析純化

通過階段式IMAC層析純化，電泳結果表明目的蛋白主要存在于100-200 mmol/L咪唑洗脫峰中，見圖1。

1:Fusion Protein M:Marker

2.3融合分子的酶切和分離

融合蛋白分子經腸激酶作用后,由21 KD的完整分子被切割成16.5 KD和4.5 KD的兩個片段，再經過一次IMAC，4.5 KD的目的片段在流川峰中被洗脫下來，電泳檢測純度達94%左右。

3討論

由于HBD2具有抑菌作用，利用大腸桿菌表達系統進行HBD2的制備必須要遮蔽它的抑菌作用[3]，所以我們構建了BL21(DE3)TrX-B plysS/pET32a/TrXA- HBD2重組工程菌[4,5]。外源基因的產量表達與每一個細胞濃度及其平均表達產量是成正比例的，為重組蛋白最高產量的獲得，依賴于與其相關的多種因素。pET32a作為本實驗的表達載體，使用了T7啟動子。T7啟動子來自T7噬菌體,唯有被T7噬菌體基因1編碼的T7RNA聚合酶所識別，要使在T7啟動子調控外源基因表達，必須具備可表達T7RNA聚合酶的宿主菌，T7RNA聚合酶是一種高活性的RNA聚合酶，其合成mRNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍左右[6]。要想獲得大量的表達目的蛋白的工程菌，發酵是一個重要途徑。由于發酵的很多因素都能影響工程菌的表達量，因此合適的發酵條件非常重要，本實驗采用多種參數優化，獲得了重組工程菌BL21( DE3)TrX-B plysS/pET32a/ TrXA- HBD2的最優發酵條件并進行了罐裝發酵培養。

由于可溶性表達作為本實驗的目的蛋白表達方式，這樣就方便了純化，并同時省略了變性和復性的過程，由于添加了His Tag，融合蛋白質分子能夠與金屬離子發生親和反應，結合到金屬螯合層析介質上，特異性吸附純化蛋白質，更易純化目的蛋白，減少了損失，重組HBD2蛋白前添加了具有親和標記的六個組氨酸，組氨酸具備的咪唑基團既能將電子提供，與金屬離子結合，并且不易失活蛋白質，在后續的分離純化過程中使重組HBD2蛋白仍然保持較高的活性。同時降低了成本，利用腸激酶酶切前后蛋白質分子對金屬螯合層析介質的吸附能力差異建立了簡便易行的純化工藝，由于切入了腸激酶，簡化了工藝提高了效果。

親和層析條件溫和，操作簡單、快速，純化倍數高，甚至從復雜的蛋白質混合物中一步就可以將純化的蛋白質分離出來[7]，且活性物質回收率高，有利于含量低又不很穩定的活性物質的分離。因此，本實驗中采用自建的純化工藝對重組蛋白進行純化，獲得了純度達到94 以上的HBD2蛋白質，為HBD2生物活性檢定奠定了基礎。

參考文獻：

[1]Semple F,Dorin J R.β-defensins：multifunctional mod-ulators of infection,inflammation and more[J]．J Innate Immun,2011,4(4):337.

[2]Semple C A,Gautier P,Taylor K,et al.The changingof the guard:molecular diversity and rapid evolution of beta-defensins [J].Mol Divers,2006,10(4):575.

[3]Hongtao Wei,Xuemei Han, Guoli Zhang,et al.Expression condition optimization and product structure analysis of human β-defensin-2 fusion protein in engineered bacteria[J].Advanced Materials Research,2013,782:1080.

[4]吳劍波,張致平.微生物制藥[M].北京:化學工業出版社,2003:144-157.

[5]Hongtao Wei, Guoli Zhang,et al. High expression and preliminary purification of human β-defensin-2 fusion protein[J].Advanced Materials Research,2013,782:1076.

[6]楊喆，李太華，徐維明．大腸桿菌中外源基因表達的研究進展[J]．微生物學免疫學進展，2000，28(2)：69.

[7]李澤鴻,張國利,岳玉環,等.DAB389-(Gly4Ser)2-αMSH重組融合蛋白的構建及表達[J].中國獸醫學報,2007,27(4): 477.

The study of the fermentation conditions and purification of recombinant HBD-2

ZHANGYan，SANGXue，WEIHong-tao，etal.

(China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Abstract:ObjectiveOptimizing the fermentation conditions of engineering bacteria fusion protein of HBD-2 and purifying the obtained interest protein to lay a solid foundation for the assay of biological activity of HBD-2 recombinant protein.MethodsEngineering bacteria was ferment under the optimized condition,then collect engineering bacteria to purify and enzyme digest the target protein.ResultsOptimum fermentation condition of engineering bacteriahas been confirmed.The HBD2 fusion protein purification method has been established.ConclusionInterest protein has been obtained after fermentation and purification of HBD2 recombinant engineering bacteria,and recovery rate of interest protein has been enhanced.

Key words:HBD2；engineering bacteria; fusion protein; fermentation;protein purification

(收稿日期：2015-05-16)

作者簡介：魏洪濤(1968-)，副主任醫師，副教授，碩士生導師，多年從事口腔抗微生物抗腫瘤研究。

文獻標識碼：A

中圖分類號：TQ92

文章編號：1007-4287(2016)03-0362-02

*通訊作者