1株魚類水霉病原真菌拮抗菌的發酵條件優化

梁永增+魏冬梅+王磊

摘要：采用單因素試驗分別探討溫度、pH值、接種量、碳源、氮源、無機鹽對魚類水霉病原真菌拮抗菌菌株生長的影響，并在單因素試驗結果的基礎上，利用正交試驗設計對培養基組分進行優化。結果顯示，JL04最適培養溫度為 32 ℃，最適培養pH值為5，接種量對菌體生長的影響不顯著。由正交試驗結果得出最佳發酵培養基為胰蛋白胨 6 g/L、葡萄糖6 g/L、酵母提取物3.5 g/L、硝酸銨3.5 g/L、硫酸鎂2 g/L、氯化鈣3 g/L、硫酸錳1 g/L，最佳培養時間為18 h。在此優化條件下，該菌株發酵培養達到對數生長末期的時間縮短了2 h，能較快進入菌體密度最大的時期，為該菌株的高密度生產提供了一定依據。

關鍵詞：魚??；水霉??；條件優化；發酵；拮抗菌

中圖分類號： S941.43+1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0141-05

水霉?。⊿aprolegniasis）是嚴重威脅淡水養殖魚類的世界性病害。水霉病是繼發性感染疾病，流行很廣泛[1]，一年四季均可發病[2]，晚冬、初春季節尤為嚴重，對寄主無嚴格的選擇性，水產動物及卵均可被感染，對養殖產業造成了巨大經濟損失[3-4]。以生物拮抗為核心的生物防治方法具有綠色、環保、安全、高效的優點，近年來水產領域水霉病生物防治研究進展較快[5]，代表了水霉病防控研究的主流方向。生態防治在控制病原菌數量、減少魚類疾病發生的同時還能改善養殖環境、維護微生態平衡；因此，水霉病生態防治拮抗菌的開發變得尤其重要，拮抗菌的發酵條件也成為重點研究課題。

對水霉病的治療現已進行了多種嘗試，最初采用孔雀石綠、氯化鈉、臭氧、福爾馬林[6]，其中孔雀石綠的治療效果最好，但由于孔雀石綠具有相當強的副作用并造成嚴重的污染，目前已被禁用[7]。在對水霉病各方面的研究中，一種更為有效的解決途徑是利用生物間的相互作用控制水霉。近年來，中外學者對水霉病生物防治的研究已取得了一定成果，張書俊等[8]、劉莉莉等[9]、趙春暉等[10]、Balcázar等[11]已篩選出對水霉具有較強抑制作用的拮抗菌，并對其拮抗物質進行了初步的分離鑒定。筆者所在實驗室分離得到1株水霉病原真菌拮抗菌JL04，經鑒定為枯草芽孢桿菌，以下簡稱“JL04菌株”。以JL04菌株為研究對象，對其發酵培養基組分及發酵培養條件進行優化，為今后JL04菌株的大規模發酵培養提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種 供試菌種為水霉病原菌拮抗菌中具有廣譜抑菌性的菌株JL04，由筆者所在實驗室前期篩選得到。以LB斜面保存于4 ℃冰箱中。

1.1.2 培養基 馬鈴薯葡萄糖培養基（合成培養基，pH值7.0）用于水霉的培養和保存。牛肉膏蛋白胨培養基（牛肉膏3.0 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5.0 g/L）用于細菌的分離、培養、保存。LB培養基（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L，pH值7.0）用于細菌的發酵培養。

1.1.3 試劑與儀器 主要試劑見表1，儀器設備見表2。

1.2 方法和步驟

1.2.1 水霉菌株及其拮抗菌株的培養 從長滿水霉菌絲的平板上切取直徑為1 cm的水霉瓊脂塊，接種于水霉培養基平板中央，于25 ℃下恒溫培養。將保存于4 ℃冰箱中的JL04菌株用接種環挑取菌落，在LB培養基平板上劃線，于37 ℃下恒溫活化培養?；罨蟮腏L04菌株用于發酵培養。

1.2.2 JL04菌株拮抗作用廣譜性 采用平板對峙培養法，分別對12株“1.2.1”節活化完成的水霉菌株進行拮抗廣譜性試驗。將直徑1 cm的水霉瓊脂塊接種于PDA培養基平板中央，距水霉瓊脂塊一側25 mm處，接種20 μL發酵培養的拮抗菌JL04于滅菌濾紙片上，放置0.5 h，于25 ℃下恒溫倒置培養72 h，觀察拮抗效果。

1.2.3 拮抗菌株JL04生長曲線測定 將JL04菌株接種于100 mL LB液體培養基中，置于37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養12 h，用作種子液。取25個250 mL錐形瓶，每瓶裝有100 mL LB液體培養基，以0.5%的接種量將菌懸液接入24個錐形瓶，以無菌LB液體培養基作為空白對照，均置于 37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養。分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36 h取樣，采用紫外分光光度計測定D值（λ=600 nm），每份樣品測定3次取平均值。如果菌懸液濃度過高，適當稀釋后再進行測定。以培養時間為橫坐標、D600 nm值為縱坐標，繪制拮抗菌JL04的生長曲線。

1.2.4 JL04菌株培養條件的優化

1.2.4.1 JL04菌株溫度條件的優化 將拮抗菌JL04種子培養液按照0.5%的接種量接種至100 mL LB發酵培養基中，均調pH值至7.0，分別置于27、32、37、42 ℃下以 120 r/min 搖床培養20 h，測定不同溫度下JL04菌株培養液的D600 nm值。每組試驗設3個平行。

1.2.4.2 JL04菌株最適初始pH值的確定 采用1 mol/L HCl或NaOH將LB發酵培養基的pH值分別調至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，按0.5%的接種量將JL04種子培養液接種至不同pH值的培養液中，置于37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養20 h，測定不同pH值下JL04培養液的D600 nm值。每組試驗設3個平行。

1.2.4.3 JL04菌株最佳接種量的確定 接種量設置梯度為1%、2%、3%、4%、5%。將拮抗菌接種于LB發酵培養液，在上述優化后的pH值和溫度下發酵，制成種子菌液，以不同接種量接種于100 mL液體培養基中，置于37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養20 h，測定不同接種量發酵液的D600 nm值。每組試驗設3個平行。

1.2.5 JL04菌株培養基組分優化

1.2.5.1 碳源優化 以1%硫酸銨為氮源，選擇葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、果糖、麥芽糖、葡萄糖+胰蛋白胨（質量比1 ∶1）、可溶性淀粉+胰蛋白胨（質量比1 ∶1）替代LB基礎液體發酵培養基中的胰蛋白胨制成培養基，用量均為1%，配成100 mL培養液，調節pH值至7.0。將JL04菌株種子培養液按照0.5%的接種量接種至不同碳源的培養液中，置于 37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養20 h。測定不同碳源JL04培養液的D600 nm值。每組試驗設3個平行。

1.2.5.2 氮源優化 以1%蔗糖為碳源，選擇酵母提取物、尿素、牛肉膏、硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀+酵母提取物（1 ∶1）、硝酸銨+酵母提取物（1 ∶1）、硫酸銨+酵母提取物（1 ∶1）、硝酸鉀+硫酸銨（1 ∶1）為氮源，分別以0.5%的量配成100 mL培養液，調節pH值至7.0。將JL04培養液按照0.5%的接種量接種至不同氮源的培養液中，置于37 ℃、120 r/min 搖床中振蕩培養20 h。測定不同氮源JL04培養液的D600 nm值。每組試驗設3個平行。

1.2.5.3 無機鹽優化 以1%蔗糖為碳源、0.5%酵母浸膏為氮源，選擇氯化鈣、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸錳、硫酸鎂+氯化鈣+硫酸錳（質量比2 ∶3 ∶1）代替LB液體培養基中的氯化鈉制成培養基，分別以1%的量配成100 mL培養液，調節pH值至7.0。將JL04種子懸液以0.5%的接種量接種至不同無機鹽的培養液中，置于37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養20 h。測定不同無機鹽JL04培養液的D600 nm值。每組試驗設3個平行。

1.2.6 正交試驗 正交試驗用以優化培養基最佳用量配比。通過單因素試驗確定了JL04菌株發酵培養的最佳碳源、氮源、無機鹽。采用L9（33）正交表（表3）進行試驗，以0.5%的接種量接菌懸液，每個培養基組合設3個平行，共9組試驗。均置于37 ℃、120 r/min搖瓶發酵培養20 h，測定發酵液的D600 nm值，以確定最佳培養基組合。每組試驗設3個平行。

1.2.7 優化后生長曲線的測定 將JL04菌株接種于100 mL優化后的液體培養基中，置于37 ℃、120 r/min搖床中振蕩過夜培養，用作種子懸液。取25個250 mL錐形瓶，每瓶裝 100 mL 優化后的液體培養基，以0.5%的接種量將菌懸液接入24個錐形瓶，以無菌LB液體培養基作為空白對照，均置于37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養。分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36 h取樣，采用紫外分光光度計測定D600 nm值，每份樣品取樣3次并取測量結果的平均值。如果菌懸液濃度過高，適當稀釋后再進行測定。以培養時間為橫坐標、D600 nm值為縱坐標，繪制JL04菌株在優化后培養基中的生長曲線。

2 結果與分析

2.1 JL04菌株對魚類水霉病病原菌水霉的拮抗效果

采用平板對峙培養法，由試驗結果（圖1）可知，JL04菌株對12株水霉病原真菌均有拮抗性，JL04菌株是生物防治水霉病的1株理想菌株，因此對具有廣譜抑菌性的JL04菌株進行發酵條件優化尤為重要。

2.2 生長曲線測定

拮抗菌JL04菌株在LB液體培養基中的生長曲線見圖2。該菌株在LB培養基中0～4 h處于潛伏期，菌體生長量少；4 h后進入對數生長期，菌體數量急劇增加；于20 h達到生長高峰；20～36 h進入穩定期。試驗結果表明，JL04菌株在液體培養基中的增殖情況符合細菌的一般生長規律，經歷了延遲期、 對數期、 穩定期、衰亡期。在20 h后JL04菌株生長進入了穩定期，細菌增殖不明顯；因此，在LB培養基中發酵20 h為拮抗菌JL04菌株對數生長的末期，此時期內收集的菌液適合作為種子懸液。

2.3 JL04菌株培養條件的優化

2.3.1 JL04菌株溫度條件的選擇 溫度對蛋白質及生物酶的活性影響很大，而蛋白質和生物酶又是生物代謝過程中的重要物質，因此溫度對于微生物的生長具有很大影響。培養溫度過低或過高均會造成微生物生長緩慢，甚至導致微生物死亡。由圖3可知，32 ℃條件下JL04菌株長勢最好，與其他溫度相比差異顯著，因此拮抗菌JL04的最適生長溫度應在 32 ℃ 左右。試驗結果表明，JL04菌株對溫度比較敏感，在進行培養時，32 ℃是比較理想的溫度。

2.3.2 最適初始pH值的確定 pH值能影響微生物細胞膜表面電荷及膜的通透性，進而影響對物質的吸收能力。另外，pH值還能改變酶活性、酶促反應的速率及代謝途徑。過堿性或過酸性的環境會導致微生物生長緩慢，甚至導致細菌死亡。

細菌在生長過程中所產生的胞外物質會改變發酵液的pH值，因此僅能控制其初始pH值。由圖4可知，拮抗菌JL04在初始pH值為5～6時長勢最好，與其他組相比差異顯著，可見拮抗菌JL04更適合在略偏酸性的環境中生長。試驗結果表明，培養基的初始pH值為5～6時更適合JL04菌株的生長。

2.3.3 接種量的選擇 接種量是與培養基的利用率直接相關的量。接種量太大則菌種吸收不到足夠多的營養，菌數不高且造成浪費；接種量太小對營養利用不充分，且細菌發酵周期延長，增加染菌概率。分別以不同接種量（1%、2%、3%、4%、5%）接種于培養基中進行發酵培養，以培養得到的拮抗菌株發酵液的D600 nm值表示菌量。由圖5可知，接種量在3%時拮抗菌JL04的長勢最好。單因素方差分析表明， 5個接種量之間沒有顯著性差異，因此接種量對拮抗菌JL04的發酵生長影響不大。

2.4 JL04菌株培養基組分優化

2.4.1 碳源優化 根據微生物所能產生的酶系不同，不同微生物可利用不同的碳源。碳源對微生物生長代謝的作用主要是提供細胞的碳架，提供細胞生命活動所需的能量，提供合成產物的碳架。碳源在制作微生物培養基或細胞培養基時具有重要作用，為微生物或細胞的正常生長、分裂提供物質基礎。由圖6可知，以10 g/L胰蛋白胨+葡萄糖（1 ∶1）為碳源的發酵液D600 nm值最高，與其他單一碳源相比差異顯著；其次為胰蛋白胨+可溶性淀粉（1 ∶1），再次分別為葡萄糖、可溶性淀粉；而果糖、麥芽糖、蔗糖作為碳源時發酵液的D600 nm值均低于原培養基，因此選用胰蛋白胨+葡萄糖（1 ∶1）作為碳源。

2.4.2 氮源優化 微生物生長和產物合成需要氮源，氮源主要用于菌體細胞物質（氨基酸、蛋白質、核酸等）和含氮代謝物的合成。氮源是微生物必需的營養物質之一，對微生物的生命活動意義重大。由圖7可知，JL04菌株在以酵母提取物+硝酸銨（1 ∶1）為氮源的培養基中長勢最好，其次為酵母提取物+硫酸銨（1 ∶1），再次分別為酵母提取物+硝酸鉀（1 ∶1）、酵母提取物、牛肉膏、硝酸鉀+硫酸銨（1 ∶1）、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀、尿素。該結果可能的原因是有機氮源與無機氮源相比更易被利用，因此有機氮源對菌體生長更加有利。試驗結果表明，選用酵母提取物+硝酸銨（1 ∶1）作為氮源有利于JL04菌株的發酵培養。

2.4.3 無機鹽種類的優化 無機鹽是細胞的結構成分，參與并維持生物體的代謝活動，維持生物體內的酸堿平衡及滲透壓。對微生物生長的重要性可見一斑。由圖8可知，以硫酸鎂+氯化鈣+硫酸錳（2 ∶3 ∶1）作為無機鹽的培養基發酵液D600 nm值最高；其次分別為氯化鈣、硫酸鎂、硫酸錳；而磷酸氫二鉀作為無機鹽時，發酵液的菌量均沒有原培養基效果好，因此選用硫酸鎂+氯化鈣+硫酸錳（2 ∶3 ∶1）作為培養基的無機鹽。

2.5 正交試驗結果

由表4可知，發酵培養基組分的最佳組合為A3B3C1，即拮抗菌JL04菌株的最佳培養基為6 g/L胰蛋白胨+6 g/L葡萄糖+ 3.5 g/L酵母提取物+3.5 g/L硝酸銨+2 g/L 硫酸鎂+3 g/L氯化鈣+1 g/L硫酸錳。極差分析表明，RA>RB>RC，即各因子對菌體濃度的影響大小依次為葡萄糖+胰蛋白胨>硝酸銨+酵母提取物>硫酸鎂+氯化鈣+硫酸錳。由表5可知，葡萄糖+胰蛋白胨差異顯著，而硫酸鎂+氯化鈣+硫酸鎂在統計學上沒有顯著性差異。

2.6 拮抗菌JL04在發酵培養基中生長曲線的測定

由圖9可知，該菌株在優化后的培養基中0～4 h處于潛伏期，菌體生長量少；4 h后進入對數生長期，菌體數量急劇增加；18 h達到生長高峰；18～36 h進入穩定期。在優化培養基中發酵18 h為拮抗菌JL04菌株對數生長的末期，此時期內收集的菌液適合作為菌種液，能得到高濃度的菌體。

與優化前的培養基相比，拮抗菌JL04在優化后培養基中的對數生長末期提前了2 h，縮短了菌體發酵培養時得到最高濃度菌量的培養時間；而且優化前后該菌達到對數生長末期時的菌量不同，優化后對數生長末期菌量明顯增大，這對于大量產生菌體來抑制水霉病原菌具有一定意義。

3 結論與討論

通過單因素試驗和正交試驗，初步得到了實驗室條件下JL04菌株液體發酵的培養基優化配方，即6g/L胰蛋白胨、6 g/L 葡萄糖、3.5 g/L酵母提取物、3.5 g/L硝酸銨、2 g/L硫酸鎂、3 g/L氯化鈣、1 g/L硫酸錳。發酵條件的研究結果表明，菌株JL04對溫度和pH值較為敏感，其生長最適溫度為32 ℃，最適pH值為5～6，接種量對菌體生長的影響不顯著。篩選后的培養基碳源、氮源、無機鹽明確，且菌株JL04在優化后的培養基中達到對數生長末期的時間縮短，能較快進入菌體密度最大期，為該菌株的高密度生產提供依據。

本試驗僅在實驗室條件下對發酵培養基的組成及其培養條件進行了優化，而拮抗菌制劑生防作用的發揮與制備工藝、使用方法以及菌劑使用時的溫度、濕度、pH值等環境因素密切相關。在拮抗菌制劑商業化過程中，一方面要繼續加強對拮抗菌活性物質發酵工藝、提取與純化方法等的研究，另一方面要加強對拮抗菌制劑發揮最佳作用條件的研究，需在發酵罐和水環境下進行驗證。本試驗對最佳碳源、氮源、無機鹽離子和正交試驗法優化培養基配比進行了研究，僅以液體發酵培養基中的總菌含量作為指標，并沒有其他與之相對應的篩選模型作為依據，因此可能對試驗結果造成一定誤差，但并不影響本研究所得結果。今后的研究中可設計類似試驗方案，以進一步驗證本試驗的準確性和完整性。

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