豬場排污口大腸桿菌耐氯霉素基因FLO的分子流行病學調查

宋麗娜

摘要：采用建立PCR的方法對實驗室保存的135株規?；B豬場排污口的大腸桿菌進行了氯霉素耐藥基因FLO的檢測。結果顯示135株大腸桿菌中氯霉素抗性基因FLO的檢出率為 36.7 %，證實該耐藥基因在豬場排污口普遍存在。

關鍵詞：大腸桿菌；耐藥基因FLO；分子流行病學；豬場排污口

中圖分類號：S852.61 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2016）02-0007-01

大腸埃希菌是醫學和獸醫臨床上最常見的一種病原菌，是人及動物的主要共生菌，其抗原性復雜，血清型多樣，引起的臨床癥狀和病理變化多樣，且多與病毒性疾病和其他細菌性疾病并發，給人類及畜牧業的發展造成了嚴重的經濟損失，嚴重危害畜禽及人類的健康，每年由大腸埃希菌病帶來的經濟損失數以億計，所造成的危害十分嚴重。在醫學上曾報道感染大腸埃希菌O157后的平均死亡率為1.5%，病程平均時間6.9周。據估計，全球每年因感染產毒素性大腸埃希菌至少可導致6.5億人發病，并引起約80萬5歲以下兒童死亡。我國不少地區大腸埃希菌在腹瀉病人的病原譜中占首位。在獸醫臨床上大腸埃希菌造成的危害十分嚴重，一年四季均可致病，如仔豬的黃白痢、仔豬水腫病、禽大腸埃希菌病等，一直是困擾養殖業發展的常見病。本研究采用建立PCR的方法對實驗室保存的135株規?；B豬場排污口的大腸桿菌進行了氯霉素耐藥基因FLO的檢測。旨在為大腸桿菌病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本實驗室保存的從豬場排污口采集的135株大腸桿菌菌株。

1.1.2 試劑 TaqDNA 聚合酶購自 MBI， dNTP 及 DNA Marker-DL2000 購自北京天根生物科技有限公司，引物購自 Generay Biotech 公司。普通瓊脂平板及培養基由本實驗室配制。常規試劑為分析純。

1.1.3 儀器 PCR儀器（德國進口），凝膠電泳儀、紫外線成像系統（上海躍進醫療器械廠），CJ型超凈工作臺（蘇州百神科技網絡系統公司），高壓蒸汽滅菌鍋（上海醫用核子儀器廠），電子天平（北京賽多利斯天平有限公司），電爐、水浴箱、微量移液槍、玻棒、量筒、500 mL錐形瓶、酒精燈、EP管（0.5 μL和1.5 μL）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 模板的制備 在腸桿菌選擇性培養基麥康凱瓊脂平板上挑取單個典型紅色菌落溶入盛有100 μL滅菌蒸餾水的EP管中，放入沸水中煮10 min后迅速轉入-20 ℃環境下4 min，再于10 000 r/min離心1 min后放入4 ℃作模板備用。

1.2.2 PCR法擴增氯霉素抗性基因FLO 采用50 μL體系，包括10×PCR Buffer 5 μL，MgCl2 5 μL，上、下游引物各5 μL，dNTP 1 μL，TaqDNA 聚合酶 1 μL，模板 10 μL， 石蠟油 5 μL，滅菌蒸餾水補足至50 μL。按下列條件反應：95 ℃ 4 min，4 ℃ 50 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，72 ℃ 10 min，4℃ 60 min。30個循環。上游引物序列：5′-CTGAGGGTGTCGTCATCTA-3′；下游引物序列： 5′-GCTCCGACAATGCTGACTAT-3′。

1.2.3 凝膠電泳試驗 試驗采用瓊脂糖凝膠電泳。配制1%的瓊脂糖凝膠供檢測用， 于紫外燈下觀察電泳結果并照相。

2 結果與分析

試驗結果（圖1）表明，豬場排污口大腸桿菌普遍存在氯霉素抗性基因FLO，檢測的135株大腸桿菌中FLO 的檢出率為36.7%。

3 小結與討論

本試驗結果表明，所檢測的大腸埃希氏菌對氯霉素耐藥的基因FLO檢出率高達36.7%，說明氯霉素耐藥基因FLO在豬場排污口流行很嚴重。雖然目前國際上已經禁止氯霉素的使用，但是豬場排污口還是檢測出了耐氯霉素基因。究其原因，可能是在大腸埃希氏菌病的治療中，氯霉素類抗革蘭氏陰性菌的藥物普遍被違規使用或有氯霉素相同成分的替代藥物出現；其次，環境中存在有利于耐藥性誘導及耐藥基因轉移的條件，導致耐藥基因的普遍傳播[1，2]。

豬場排污口作為豬場與外界環境的交接點，在排污口檢測到耐藥基因，說明以往養殖場里的生物發酵、化學藥物的消毒等措施并不能阻止養殖場中大腸桿菌耐藥基因的環境釋放，而且對于很多豬場來說，排污之前并沒有采取任何措施，這直接導致耐藥基因在環境中水平傳播，對以后的動物及人的臨床用藥增加了難度。

從研究結果來看，加強養殖場排污管理迫在眉睫，而且對于獸醫臨床用藥也要規范合理化，已經禁用的氯霉素更應嚴格把關，不許違禁使用。

參考文獻：

[1] 徐小艷，王國相，印繼華，等.1975～2002年大腸桿菌耐藥性變化情況調查[J].畜牧與獸醫，2013，35（3）：29-32.

[2] 朱力軍.動物性大腸桿菌耐藥性的變化趨勢[J].中國獸藥雜志，2010，35（2）：16-18.