溴隱亭對垂體泌乳素腺瘤血管形成的影響及其分子作用機制研究

陳宏謀，鄭捷敏，閆憲磊，劉 全，黎 耀，肖振勇，陳家康

545005廣西柳州市，廣西醫科大學第四附屬醫院神經外科

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·論著·

溴隱亭對垂體泌乳素腺瘤血管形成的影響及其分子作用機制研究

陳宏謀，鄭捷敏，閆憲磊，劉 全，黎 耀，肖振勇，陳家康

545005廣西柳州市，廣西醫科大學第四附屬醫院神經外科

【摘要】目的探討溴隱亭對垂體泌乳素腺瘤血管形成的影響及其分子作用機制。方法2014年1月—2015年6月，體外培養MMQ細胞株并進行MTT比色實驗，共設置6個實驗組、1個對照組和1個空白組，實驗組在培養基和細胞懸液中添加不同濃度(0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000 μg/ml)溴隱亭，分別記為0.125 μg/ml組、0.250 μg/ml組、0.500 μg/ml組、1.000 μg/ml組、2.000 μg/ml組、4.000 μg/ml組，對照組加入等體積的培養基及細胞懸液，空白組僅加入等體積的培養基；根據半數抑制濃度(IC50)篩選最適濃度溴隱亭進行后續試驗。再采用最適濃度的溴隱亭處理MMQ細胞48 h，制備條件培養液(CM)，各實驗組在培養基和細胞懸液基礎上分別加入最適溶度的溴隱亭和CM，對照組加入等體積的培養基和細胞懸液，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測泌乳素(PRL)濃度及其變化率。用攜帶GFP基因的慢病毒(LV-GFP)感染人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)制備HUVEC/LV-GFP，用CM孵育HUVEC/LV-GFP細胞，各實驗組在培養基和細胞懸液基礎上分別加入最適濃度的溴隱亭和CM，CM組在培養基和細胞懸液基礎上僅加入CM，1.000 μg/ml組在培養基和細胞懸液基礎上僅加入1.000 μg/ml溴隱亭，對照組加入等體積培養基和細胞懸液；24 h后在熒光顯微鏡下觀察血管樣結構形成情況并計數。采用Western blotting法檢測對照組與最適濃度溴隱亭組垂體瘤轉化基因(PTTG)和血管內皮生長因子(VEGF)表達情況。結果6個實驗組MMQ細胞增殖抑制率時間與組間存在交互作用(P<0.05)；培養48 h、72 h 0.125 μg/ml組、0.250 μg/ml組、0.500 μg/ml組、1.000 μg/ml組、2.000 μg/ml組、4.000 μg/ml組MMQ細胞增殖抑制率高于培養24 h，培養72 h 0.125 μg/ml組、0.250 μg/ml組、0.500 μg/ml組、1.000 μg/ml組、2.000 μg/ml組MMQ細胞增殖抑制率高于培養48 h(P<0.05)；而培養48 h與培養72 h 4.000 μg/ml組MMQ細胞增殖抑制率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。通過軟件計算抑制MMQ細胞增殖的IC50接近0.500 μg/ml，遂選用0.250、0.500、1.000 μg/ml溴隱亭進行后續實驗。1.000 μg/ml+CM組PRL濃度及變化率均低于0.500 μg/ml+CM組、0.250 μg/ml+CM組和對照組；0.500 μg/ml+CM組PRL濃度及變化率均低于0.250 μg/ml+CM組和對照組；0.250 μg/ml+CM組PRL濃度及變化率均低于對照組(P<0.05)。CM組MMQ細胞外血管樣結構計數多于0.250 μg/ml+CM組、0.500 μg/ml+CM組、1.000 μg/ml+CM組、1.000 μg/ml組、對照組；0.250 μg/ml+CM組MMQ細胞外血管樣結構計數多于0.500 μg/ml+CM組、1.000 μg/ml+CM組、1.000 μg/ml組、對照組；0.500 μg/ml+CM組MMQ細胞外血管樣結構計數多于1.000 μg/ml+CM組、1.000 μg/ml組、對照組；1.000 μg/ml+CM組MMQ細胞外血管樣結構計數多于1.000 μg/ml組、對照組；1.000 μg/ml組與對照組MMQ細胞外血管樣結構計數比較，差異無統計學意義(P>0.05)。對照組PTTG、VEGF表達水平高于0.250 μg/ml組、0.500 μg/ml組、1.000 μg/ml組，0.250 μg/ml組PTTG、VEGF表達水平高于0.500 μg/ml組、1.000 μg/ml組，0.500 μg/ml組PTTG、VEGF表達水平高于1.000 μg/ml組(P<0.05)。結論溴隱亭可通過抑制垂體泌乳素腺瘤的血管形成而抑制其生長與侵襲，而這種抑制作用與下調PTTG/VEGF信號通路有關。

【關鍵詞】催乳素瘤；溴隱亭；血管內皮生長因子類

陳宏謀，鄭捷敏，閆憲磊，等.溴隱亭對垂體泌乳素腺瘤血管形成的影響及其分子作用機制研究[J].實用心腦肺血管病雜志，2016，24(3)：43-48.[www.syxnf.net]

Chen HM，Zheng JM，Yan XL，et al.Impact of bromocriptine on vascularization of prolactinoma and the molecular mechanism[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2016，24(3)：43-48.

垂體瘤是顱內常見疾病之一，占顱內腫瘤的10%～15%，其中垂體泌乳素腺瘤(prolactinoma)占30%左右[1]。外科手術是治療垂體泌乳素腺瘤的首選方案，而溴隱亭是不能耐受手術或拒絕手術治療患者的最佳選擇。溴隱亭單獨使用或結合外科手術治療垂體泌乳素腺瘤已取得較好的臨床療效[2]。垂體泌乳素腺瘤的生長和轉移依賴新生血管的形成，而腫瘤血管的形成極為復雜，包括正常靜脈血管系統激活、新生血管出芽以及腫瘤細胞、內皮細胞、外周細胞間相互作用等多種因素共同作用。血管內皮生長因子(VEGF)是迄今公認的最重要的血管形成因子，其可在多種生理、病理狀態下促進周圍血管的形成。垂體瘤轉化基因(PTTG)在正常垂體中不表達，而在垂體瘤中高表達。PTTG、VEGF對腫瘤血管的形成起重要作用。有研究表明，上調PTTG和VEGF表達可促進垂體瘤周圍血管的形成，其表達情況可作為判斷垂體瘤侵襲性的一項生物學指標，對判斷患者預后也有一定的臨床意義[3]。

本研究旨在分析溴隱亭對大鼠垂體泌乳素腺瘤MMQ細胞泌乳素(prolactin，PRL)分泌、血管形成及PTTG、VEGF表達的影響，初步探討溴隱亭對垂體泌乳素腺瘤的治療作用是否與通過調節PTTG/VEGF通路而抑制血管形成有關，為臨床上應用溴隱亭治療垂體泌乳素腺瘤提供參考。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1細胞株與病毒大鼠垂體泌乳素腺瘤細胞株MMQ及人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)均購自American Type Culture Collection(ATCC)公司，攜帶GFP基因的慢病毒(LV-GFP)由Gene Chem公司制備。

1.1.2主要試劑及試劑盒溴隱亭(Gedeon Richter Plc.)，噻唑藍(MTT，Sigma)，F12培養基(Hyclone)，胎牛血清(Hyclone)，馬血清(Gibco)，0.25%胰蛋白酶消化液(Hyclone)，二甲基亞砜(DMSO，Amresco)，Polybrene(Sigma)；Matrigel(Sigma)，鼠源性抗VEGF、PTTG單克隆抗體(Santa Cruz)，鼠源性抗GAPDH單克隆抗體(Santa Cruz)，化學發光試劑ECL(Pierce)，辣根過氧化物酶標記的二抗羊抗鼠IgG(Santa Cruz)；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(BOSTER)，BCA蛋白定量試劑盒(Pierce)。

1.2實驗方法

1.2.1MTT比色法2014年1月—2015年6月，將MMQ細胞復蘇后在含10%胎牛血清和5%馬血清的F12培養基中培養，置于37 ℃、5% CO2培養箱中常規傳代培養，觀察細胞狀態，待生長良好即進行下一步實驗。取處于對數生長期的MMQ細胞，制成1×105個/ml細胞懸液，加入96孔板中，100 μl/孔(邊緣孔用無菌的PBS填充)，37 ℃、5% CO2培養箱孵育過夜。共設置6個實驗組、1個對照組和1個空白組，實驗組加入培養基、細胞懸液和不同濃度(0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000 μg/ml)溴隱亭，分別記為0.125 μg/ml組、0.250 μg/ml組、0.500 μg/ml組、1.000 μg/ml組、2.000 μg/ml組、4.000 μg/ml組，對照組加入等體積的培養基及細胞懸液，空白組僅加入等體積的培養基，每組設6個復孔。置于培養箱中培養24、48、72 h后，每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，繼續培養4 h后，每孔加入150 μl DMSO；振蕩10 min后，用酶標儀在570 nm波長處測量吸光度(OD)，并計算MMQ細胞增殖抑制率。實驗獨立重復3次。MMQ細胞增殖抑制率=〔1-(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)〕×100%。并根據各組MMQ細胞增殖的半數抑制濃度(IC50)選取最適濃度的溴隱亭進行后續試驗。

1.2.2制備條件培養液(CM)和提取總蛋白取對數生長期的MMQ細胞，制成2×105個/ml的細胞懸液，加入6孔板中，1 ml/孔，置于培養箱中過夜。在孔板中加入最適濃度的溴隱亭培養48 h后，離心取上清液即為CM(4 ℃保存)；6孔板中加入細胞裂解液，提取總蛋白(70 ℃保存)。

1.3ELISA檢測CM中PRL濃度各實驗組在培養基和細胞懸液基礎上分別加入最適溶度的溴隱亭和CM，對照組加入等體積的培養基和細胞懸液：(1)將100 μl的上述CM和標準品(標準品按試劑盒說明稀釋)加入相應的反應孔中，37 ℃孵育2 h，洗板5次；(2)每孔加100 μl一抗，37 ℃孵育2 h，洗板5次；(3)每孔加100 μl酶標二抗，37 ℃孵育30 min，洗板5次；(4)每孔加100 μl底物工作液37 ℃避光孵育15 min，洗板5次；(5)每孔加100 μl終止液混勻；(6)用酶標儀在450 nm波長處測量OD值；(7)根據標準曲線計算樣本OD值對應的PRL濃度，并計算變化率，變化率(%)=(實驗組PRL濃度/對照組PRL濃度)×100%。實驗獨立重復3次取平均值。

1.4體外血管形成

1.4.1慢病毒感染制備HUVEC/LV-GFP細胞將HUVEC細胞接種于24孔板中培養，24 h后用LV-GFP感染，根據細胞的增殖特性調整細胞密度，使感染時細胞匯合度為30%～40%。將60 μl LV-GFP(滴度為1×108 TU/ml)與435 μl培養液及5 μg/ml Polybrene 5 μl混勻制成感染混合體系，吸去細胞培養液，加入感染混合體系，37 ℃下孵育24 h，然后更換為常規培養液，72 h后用1 μg/ml嘌呤霉素篩選穩定表達GFP的細胞，即HUVEC/LV-GFP細胞。

1.4.2體外血管形成實驗在96孔板加入Matrigel，50 μl/孔，37 ℃孵育1 h；將HUVEC/LV-GFP細胞懸液加入Matrigel上層，5×103個/孔；用CM孵育HUVEC/LV-GFP細胞。各實驗組在培養基和細胞懸液基礎上分別加入最適濃度的溴隱亭和CM，CM組在培養基和細胞懸液基礎上僅加入CM，1.000 μg/ml組在培養基和細胞懸液基礎上僅加入1.000 μg/ml溴隱亭，對照組加入等體積的培養基和細胞懸液。24 h后，在熒光顯微鏡下觀察血管樣結構的形成情況，任意取5個視野，計數血管樣結構。實驗獨立重復3次取平均值。

1.5Western blotting法(1)用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，取一定體積總蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳。(2)100 V恒壓電泳至溴酚藍遷移到分離膠底部0.5 cm處，300 mA恒流轉膜(PVDF膜)90 min。(3)用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉PVDF膜；加入適當稀釋的一抗，封于塑料膜中4 ℃過夜；用TBST洗滌，加入適當稀釋的二抗，室溫孵育1 h；用TBST洗滌。(4)用增敏化學發光底物試劑(ECL)處理后在顯影儀中曝光成像，并用Image J軟件進行灰度分析，以GAPDH作為內參照。實驗獨立重復3次取平均值。

2結果

2.1各組MMQ細胞增殖抑制率比較6個實驗組MMQ細胞增殖抑制率時間與組間存在交互作用(P<0.05)；培養24h、48h、72h6組MMQ細胞增殖抑制率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。其中培養48h、72h0.125μg/ml組、0.250μg/ml組、0.500μg/ml組、1.000μg/ml組、2.000μg/ml組、4.000μg/ml組MMQ細胞增殖抑制率高于培養24h，培養72h0.125μg/ml組、0.250μg/ml組、0.500μg/ml組、1.000μg/ml組、2.000μg/ml組MMQ細胞增殖抑制率高于培養48h，差異有統計學意義(P<0.05)；而培養48h與培養72h4.000μg/ml組MMQ細胞增殖抑制率比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表1)。通過軟件計算抑制MMQ細胞增殖的IC50接近0.500μg/ml，遂選用0.250、0.500、1.000μg/ml溴隱亭進行后續實驗。

Table1ComparisonofinhibitionratioofMMQcellproliferationamongthesixgroupswithdifferentconcentrationofbromocriptine

組別培養24h培養48h培養72h0.125μg/ml組27.12±2.2432.89±3.45a43.57±3.89ab0.250μg/ml組36.33±2.2641.44±3.22a55.59±3.12ab0.500μg/ml組50.48±1.5558.88±1.67a75.68±1.22ab1.000μg/ml組63.22±3.4574.24±3.89a86.22±2.24ab2.000μg/ml組75.65±3.2278.56±3.12a92.01±2.26ab4.000μg/ml組90.34±1.6796.44±1.22a96.67±1.55aF值F組間=103.32,F時間=44.58,F交互=115.07P值P組間=0.00,P時間=0.00,P交互=0.00

注：與培養24 h比較，aP<0.05；與培養48 h比較，bP<0.05

2.2對照組與最適濃度溴隱亭組PRL濃度及變化率比較4組PRL濃度及變化率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中1.000 μg/ml+CM組PRL濃度及變化率均低于0.500 μg/ml+CM組、0.250 μg/ml+CM組和對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；0.500 μg/ml+CM組PRL濃度及變化率均低于0.250 μg/ml+CM組和對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；0.250 μg/ml+CM組PRL濃度及變化率均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

表2對照組與最適濃度溴隱亭組PRL濃度及變化率比較

Table2ComparisonofPRLconcentrationandthechangerateamongcontrolgroupandtestgroupswithbestconcentrationofbromocriptineandCM

組別PRL(μU/ml)變化率(%)對照組85.66±1.34100.00±1.230.250μg/ml+CM組55.21±2.82a64.45±2.22a0.500μg/ml+CM組40.19±3.11ab46.92±1.89ab1.000μg/ml+CM組30.33±2.67abc35.41±33.11abcF值103.3379.54P值0.0060.000

注：PRL=泌乳素；與對照組比較，aP<0.05；與0.250 μg/ml+CM組比較，bP<0.05；與0.500 μg/ml+CM組比較，cP<0.05

2.3對照組、1.000 μg/ml組、CM組與最適濃度溴隱亭組MMQ細胞外血管樣結構計數比較6組MMQ細胞外血管樣結構計數比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中CM組MMQ細胞外血管樣結構計數多于0.250 μg/ml+CM組、0.500 μg/ml+CM組、1.000 μg/ml+CM組、1.000 μg/ml組、對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；0.250 μg/ml+CM組MMQ細胞外血管樣結構計數多于0.500 μg/ml+CM組、1.000 μg/ml+CM組、1.000 μg/ml組、對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；0.500 μg/ml+CM組MMQ細胞外血管樣結構計數多于1.000 μg/ml+CM組、1.000 μg/ml組、對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；1.000 μg/ml+CM組MMQ細胞外血管樣結構計數多于1.000 μg/ml組、對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；1.000 μg/ml組與對照組MMQ細胞外血管樣結構計數比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表3)。

2.4對照組與最適濃度溴隱亭組PTTG、VEGF表達水平比較4組PTTG、VEGF表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中對照組PTTG、VEGF表達水平高于0.250 μg/ml組、0.500 μg/ml組、1.000 μg/ml組，差異有統計學意義(P<0.05)；0.250 μg/ml組PTTG、VEGF表達水平高于0.500 μg/ml組、1.000 μg/ml組，差異有統計學意義(P<0.05)；0.500 μg/ml組PTTG、VEGF表達水平高于1.000 μg/ml組，差異有統計學意義(P<0.05，見表4)。不同溴隱亭濃度組PTTG、VEGF表達水平電泳圖見圖1。

Table 3Comparison of capillary structure count of MMQ cells among control group and test groups with best concentration of bromocriptine，with/without CM

組別血管樣結構計數對照組10.33±0.10abcd1.000μg/ml組9.3±0.05abcd1.000μg/ml+CM組20.5±0.90abc0.500μg/ml+CM組40.33±1.10ab0.250μg/ml+CM組55.23±1.90aCM組90.22±1.40F值119.43P值0.000

注：與CM組比較，aP<0.05；與0.250 μg/ml+CM組比較，bP<0.05；與0.500 μg/ml+CM組比較，cP<0.05；與1.000 μg/ml+CM組比較，dP<0.05

表4對照組和最適濃度溴隱亭組PTTG、VEGF表達水平比較

Table4ComparisonofexpressionsofPTTGandVEGFamongcontrolgroupandtestgroupswithbestconcentrationofbromocriptine

組別PTTGVEGF對照組1.00±0.011.00±0.010.250μg/ml組0.59±0.02a0.69±0.02a0.500μg/ml組0.29±0.01ab0.58±0.01ab1.000μg/ml組0.15±0.02abc0.36±0.02abcF值109.32105.02P值0.0070.009

注：PTTG=垂體瘤轉化基因，VEGF=血管內皮生長因子；與對照組比較，aP<0.05；與0.250 μg/ml組比較，bP<0.05；與0.500 μg/ml組比較，cP<0.05

注：PTTG=垂體瘤轉化基因，VEGF=血管內皮生長因子

圖1對照組與最適濃度溴隱亭組PTTG、VEGF表達水平的電泳圖

Figure 1Electrophoretogram for expressions of PTTG and VEG of control group and test groups with best concentration of bromocriptine

3討論

溴隱亭作為臨床最常用的一種D2受體激動劑，在侵襲性垂體泌乳素腺瘤的臨床治療中已被證明安全有效。溴隱亭可使80%～90%患者的血清PRL水平恢復至參考范圍,使60%～75%垂體泌乳素大腺瘤患者腫瘤縮小，使80%～90%垂體泌乳素微腺瘤和60%～75%大腺瘤患者恢復性腺功能[4-6]。19世紀70年代，Folkman[7]提出腫瘤的生長和轉移依賴于血管形成的假說。垂體泌乳素腺瘤的生長和侵襲亦依賴于腫瘤血管的形成，而腫瘤血管的形成過程極為復雜，與腫瘤細胞分泌的許多生長因子有關，目前已有文獻指出參與調控腫瘤血管形成的生長因子有30多種，而在眾多調控因子中VEGF是最重要的促進血管生成因子之一[8-9]。VEGF是目前公認的作用最強、特異性最高的腫瘤血管形成的關鍵調控因子，其由多種正常細胞和腫瘤細胞分泌，在多種腫瘤組織的血管形成中起關鍵作用[10]。在腫瘤的生長和侵襲過程中，當腫瘤細胞與內皮細胞通過縫隙連結相互作用后,VEGF分泌增加,基質金屬蛋白酶1(MMP-1)明顯升高，基質金屬蛋白酶原2(Pro-MMP-2)活化，胞膜型基質金屬蛋白酶1(MT1-MMP)、尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)、纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)表達增高，從而促進腫瘤侵襲和腫瘤血管的形成。多種因子可通過調節VEGF水平或血管內皮生長因子受體(VEGFR)活性而參與血管形成和調節，如在缺血缺氧環境下，腫瘤血管形成可通過誘導缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)增多而實現。VEGF是腫瘤血管形成過程中最重要的刺激因子，同時又是缺氧誘導因子1(HIF-1)重要的靶基因，機體缺氧時HIF-1能調節VEGFR表達上調，促進血管內皮細胞增生并形成新的血管，以滿足自身營養供應[11]。PTTG是1997年從鼠垂體腫瘤細胞分離并確定的垂體洐生轉化基因,與腫瘤血管形成關系密切[12]。PTTG可通過正反饋機制促進堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的表達，參與腫瘤血管的形成；且PTTG與基質金屬蛋白酶2(MMP-2)成正相關，可抑制腫瘤血管生成[13]；PTTG也可能通過p53抑制血小板反應蛋白(TSP-1)的表達，從而促進腫瘤血管生成?？傊?，PTTG可通過多條途徑誘導腫瘤血管生成。而PTTG與VEGF之間是否存在相關性，目前尚不明確。有學者認為，PTTG可上調VEGF和血管內皮生長因子受體(KDR)的表達，因此提出了PTTG/VEGF/KDR自分泌信號通路[14-15]。也有學者認為，盡管PTTG確實存在誘導血管形成的作用，但未必是通過調節VEGF表達而實現，兩種基因表達不存在關聯性[16]。因此，在腫瘤血管形成方面，PTTG與VEGF的關系尚需進一步探究。

本研究中MTT實驗和ELISA結果顯示，培養24 h、48 h、72 h，0.125 μg/ml組、0.250 μg/ml組、0.500 μg/ml組、1.000 μg/ml組、2.000 μg/ml組、4.000 μg/ml組MMQ細胞增殖抑制率間有差異；其中培養48 h、72 h 0.125 μg/ml組、0.250 μg/ml組、0.500 μg/ml組、1.000 μg/ml組、2.000 μg/ml組、4.000 μg/ml組MMQ細胞增殖抑制率高于培養24 h，培養72 h 0.125 μg/ml組、0.250 μg/ml組、0.500 μg/ml組、1.000 μg/ml組、2.000 μg/ml組MMQ細胞增殖抑制率高于培養48 h。1.000 μg/ml+CM組PRL濃度及變化率均低于0.500 μg/ml+CM組、0.250 μg/ml+CM組和對照組；0.500 μg/ml+CM組PRL濃度及變化率均低于0.250 μg/ml+CM組和對照組；0.250 μg/ml+CM組PRL濃度及變化率均低于對照組；表明溴隱亭可抑制MMQ細胞增殖和PRL的分泌。繼而構建能穩定表達GFP的HUVEC/LV-GFP，在添加CM的培養基中培養，通過熒光顯微鏡下觀察血管樣結構形成情況發現，1.000 μg/ml組與對照組MMQ細胞外血管樣結構計數間無差異，CM組MMQ細胞外血管樣結構計數多于0.250 μg/ml+CM組、0.500 μg/ml+CM組、1.000 μg/ml+CM組、1.000 μg/ml組、對照組，0.250 μg/ml+CM組MMQ細胞外血管樣結構計數多于0.500 μg/ml+CM組、1.000 μg/ml+CM組、1.000 μg/ml組、對照組，0.500 μg/ml+CM組MMQ細胞外血管樣結構計數多于1.000 μg/ml+CM組、1.000 μg/ml組、對照組，1.000 μg/ml+CM組MMQ細胞外血管樣結構計數多于1.000 μg/ml組、對照組；表明MMQ細胞培養48 h后分泌了能促進HUVEC/LV-GFP細胞形成血管的因子，而這種因子在HUVEC/LV-GFP細胞自身合成中含量較低，溴隱亭處理MMQ細胞48 h后明顯抑制了血管的形成，且隨著溴隱亭濃度的增加，其血管形成抑制能力逐漸加強。為探索其相關機制，采用Western blotting實驗分析MMQ細胞總蛋白中PTTG和VEGF表達情況，結果顯示，對照組PTTG、VEGF表達水平高于0.250 μg/ml組、0.500 μg/ml組、1.000 μg/ml組，0.250 μg/ml組PTTG、VEGF表達水平高于0.500 μg/ml組、1.000 μg/ml組，0.500 μg/ml組PTTG、VEGF表達水平高于1.000 μg/ml組；表明PTTG和VEGF表達受溴隱亭濃度的影響。分析原因為MMQ細胞合成并分泌了PTTG和VEGF，即PTTG/VEGF信號通路，以促進HUVEC/LV-GFP細胞形成血管樣結構，而溴隱亭可抑制PTTG/VEGF信號通路。

綜上所述，溴隱亭可通過抑制垂體泌乳素腺瘤血管形成而抑制其生長與侵襲，而這種抑制作用可能與下調PTTG/VEGF信號通路有關。

作者貢獻：陳宏謀進行資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；鄭捷敏進行實驗設計并組織實施；閆憲磊、劉全、黎耀、肖振勇進行實驗實施、評估、資料收集；陳家康進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：毛亞敏)

Impact of Bromocriptine on Vascularization of Prolactinoma and the Molecular Mechanism

CHENHong-mou，ZHENGJie-min，YANXian-lei，etal.DepartmentofNeurosurgery，theFourthAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Liuzhou545005，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the impact of bromocriptine on vascularization of prolactinoma and the molecular mechanism.MethodsFrom January 2014 to June 2015，MMQ cell strains were cultured in vitro，MTT colorimetric assay was used to find the best concentration of bromocriptine.A group added 0.125 μg/ml of bromocriptine，B group added 0.250 μg/ml of bromocriptine，C group added 0.500 μg/ml of bromocriptine，D group added 1.000 μg/ml of bromocriptine，E group added 2.000 μg/ml of bromocriptine，F group added 4.000 μg/ml of bromocriptine，control group added isovolumetric culture medium and cell suspension，blank control group added isovolumetric culture medium.IC50 was calculated to find the best concentration of bromocriptine.After that，MMQ cell strains were cultured by the best concentration of bromocriptine for 48 hours，and conditioned medium(CM)was prepared at the same time，then B group added with CM served as B1 group，C group added with CM served as C1 group，D group added with CM served as D1 group，control group added isovolumetric culture medium and cell suspension as before，and ELISA method was used to detect the PRL concentration and the change rate.Lentivirus with GFP gene was used to infect the HUVEC and prepared for HUVEC/LV-GFP cells，then B group hatched by CM served as B2 group，C group hatched by CM served as C2 group，D group hatched by CM served as D2 group，control group add with CM served as control-CM group；after 24 hours of culture，fluorescence microscope was used to observe the formation and counts of capillary structure.Western blotting method was used to detect the expressions of PTTG and VEGF of control group，of B group，of C group，of D group.ResultsThere was interaction of inhibition ratio of cell multiplication between time and group among A group，B group，C group，D group，E group and F group(P<0.05)；after 48 hours，72 hours of culture，inhibition ratio of cell multiplication of A group，of B group，of C group，of D group，of E group，of F group was statistically significantly higher than that after 24 hours of culture，respectively；after 72 hours of culture，inhibition ratio of cell multiplication of A group，of B group，of C group，of D group，of E group was statistically significantly higher than that after 48 hours of culture，respectively(P<0.05)，while no statistically significant differences of inhibition ratio of cell multiplication of F group was found compared to that after 48 hours of culture(P>0.05).The calculation showed that，IC50 of inhibition of cell multiplication was close to 0.500 μg/ml.The PRL concentration and the change rate of D1 group were statistically significantly lower those of C1 group，of B1 group，of control group，PRL concentration and the change rate of C1 group were statistically significantly lower than those of B1 group，of control group，PRL concentration and the change rate of B1 group were statistically significantly lower than those of control group(P<0.05).Capillary structure count of control-CM group was statistically significant more than that of B2 group，of C2 group，of D2 group，of D group，of control group，respectively；capillary structure count of B2 group was statistically significant more than that of C2 group，of D2 group，of D group，of control group，respectively；capillary structure count of C2 group was statistically significant more than that of D2 group，of D group，of control group，respectively；capillary structure count of D2 group was statistically significant more than that of D group，of control group，respectively(P<0.05)；while no statistically significant differences of capillary structure count was found between D group and control group(P>0.05).Expressions of PTTG and VEGF of control group were statistically significantly higher than those of B group，of C group，of D group；expressions of PTTG and VEGF of B group were statistically significantly higher than those of C group，of D group；expressions of PTTG and VEGF of C group were statistically significantly higher than those of D group(P<0.05).ConclusionBromocriptine can inhibit development and invasion of prolactinoma by inhibiting the vascularization，the molecular mechanism is possibly correlated with the down-regulation PTTG/VEGF signaling pathway.

【Key words】Prolactinoma；Bromocriptine；Vascular endothelial growth factors

(收稿日期：2015-11-19；修回日期：2016-02-23)

【中圖分類號】R 736

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1008-5971.2016.03.012

通信作者：陳家康，545005廣西柳州市，廣西醫科大學第四附屬醫院神經外科；E-mail：lgsjwk45@163.com

基金項目：廣西壯族自治區衛生廳自籌經費科研課題(z2013624)；廣西壯族自治區臨床重點?？平ㄔO項目