馬錢苷抑制人惡性黑色素瘤細胞的作用及機制研究

黨文軍　　陳景華　　張　寧　　王加志　　黃昕紅

黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱　150040

馬錢苷抑制人惡性黑色素瘤細胞的作用及機制研究

黨文軍陳景華張寧王加志黃昕紅

黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱150040

目的探索馬錢苷抑制人惡性黑色素瘤細胞的作用和機制。 方法將實驗分為空白對照組、不同干預濃度（10、20、40、60、80 ng/mL）的馬錢苷組，分別作用24、48、72 h，采用MTT方法檢測細胞活性；依據藥物作用48 h時的IC50濃度［（74.96±7.92）ng/mL］，選取馬錢苷20、40、60 ng/mL分別干預48 h，并采用RT-PCR法檢測細胞內Bc1-2、Bax和Caspase-3 mRNA表達水平的變化；用Western b1ot檢測細胞內Bc1-2、Bax和Caspase-3蛋白水平的變化。 結果馬錢苷具有抑制A375細胞增殖的作用，并呈時間和劑量依賴性。與空白對照組比較，馬錢苷組細胞抑制凋亡因子Bc1-2的mRNA和蛋白質表達水平均明顯下調（P＜0.05或P＜0.01），促凋亡因子Bax和Caspase-3的mRNA及蛋白質表達均明顯上調（P＜0.05或P＜0.01）。結論馬錢苷能抑制A375細胞增殖，其作用機制可能與下調細胞Bc1-2 mRNA與蛋白質的表達，上調Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白質的表達，進而誘導細胞凋亡有關。

馬錢苷；人惡性黑色素瘤；A375細胞；凋亡；Bcl-2；Bax；Caspase-3

［Abstract］Objective To investigate the inhibitory effect and mo1ecu1ar mechanism of 1oganin on human ma1ignant me1anoma ce11s in vitro.Methods The experiment was divided into b1ank contro1 group and different concentrations （10，20，40，60，80 ng/mL）of 1oganin groups，dea1t for 24，48，72 h，the ce11s activity was detected by MTT method；according to the ha1f-inhibitory concentration（IC50）for 48 h［（74.96±7.92）ng/mL］，20，40，60 ng/mL of 1oganin were se-1ected for 48 h intervention.The mRNA expressions of Bc1-2，Bax and Caspase-3 were detected by RT-PCR；the protein expressions of Bc1-2，Bax and Caspase-3 were detected by Western b1ot.Results Loganin has a most effective1y inhibitory effect on A375 ce11s pro1iferation in a time and dose dependent manner.Compared with b1ank contro1 group，the mRNA and protein expression 1eve1s of apoptosis inhibiting factor Bc1-2 in the 1oganin group were down-regu1ated significant1y（P＜0.05 or P＜0.01），and the mRNA and protein expression 1eve1s of pro-apoptotic factors Bax and Caspase-3 were a11 up-regu1ated，respective1y（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion Loganin can significant1y inhibit the pro1iferation of A375 ce11s，which may be associated with inhibiting the mRNA and protein expressions of Bc1-2，improving the mRNA and protein expressions of Bax，Caspase-3，thus inducting apoptosis.

［Key words］Loganin；Human ma1ignant me1anoma；A375 ce11s；Apoptosis；Bc1-2；Bax；Caspase-3

人惡性黑色素瘤細胞是一種始于黑素細胞的皮膚惡性腫瘤，其進展快，惡性程度高，極易發生淋巴轉移，嚴重威脅人群生命健康。據2012年統計顯示，全球發病232 130例，死亡55 849例，且其發病率正逐年升高。針對該病的治療方法多樣，早期發現可手術切除，對于已經轉移的黑色素瘤患者，傳統的放化療、兔疫療法均對其不敏感［1］。中藥山茱萸具有多種生物活性，表現出抗炎、降血糖、抗心律失常、雙向調節兔疫、促進白細胞介素-2（IL-2）生成［14］的作用?，F代藥理研究提示［2-3］，山茱萸對乳腺癌細胞（MCF-7）、艾氏腹水癌細胞（EAC）、人肺癌細胞（A549）等細胞有明顯的抗腫瘤活性，是一種具有廣泛應用前景的抗癌藥。本課題組前期研究提示，高濃度的山茱萸水提取物環烯醚萜苷類成分馬錢苷，能顯著抑制人黑色素瘤A375細胞的生長［4］，但其作用機制不明確。本研究從細胞及分子水平上探討了馬錢苷抑制人惡性黑色素瘤A375細胞的效應和強度及可能的作用機制，為抗腫瘤新藥的開發提供理論依據。

1　材料與方法

1.1細胞株

人皮膚黑色素瘤細胞A375細胞由中國科學院細胞中心提供。

1.2主要藥物及試劑

馬錢苷（批號：111640-200502）購于中國食品藥品檢定研究院；HRP標記羊抗小鼠IgG（批號：BST08k13B）、HRP羊抗兔（批號：BA1054），博士德；rabbit ant-Bax（批號：15120902）、rabbit ant-Bc1-2（批號：15120901）、rabbit ant-Caspase-3（批號：15120903）、小鼠抗人β-actin單克隆抗體（批號：140925），中杉金橋。

1.3主要儀器

IX-71-21PH型倒置顯微鏡（日本O1ympus株式會社）；Tprofessiona1 PCR擴增儀（德國Biometra公司）；MK3型酶標儀（上海熱電儀器有限公司）；Cham1Ge 15000凝膠成像儀（北京賽智創業科技有限公司）。

1.4細胞分組及處理

將對數期生長的A375細胞，以5000個/孔接種于96孔板中，每孔加200 μL DMEM完全培養液，37℃、5%CO2培養箱中培養24 h。把培養基棄掉，分別加入含馬錢苷藥物6種濃度（0、10、20、40、60、80 ng/mL）培養基200 μL，各組細胞均設6個復孔，繼續培養24、48、72 h。將另一部分細胞以105個/孔接種于6孔培養板中，每組均設4個復孔，每孔加2 mL DMEM完全培養液，37℃、5%CO2培養箱中培養24 h，把培養基棄掉，分別加入含馬錢苷藥物4種濃度（0、20、40、60 ng/mL）培養基2 mL，繼續培養48 h。

1.5MTT法檢測細胞活性

細胞培養分別在24、48、72 h至結束前4 h每孔加20 μL MTT（5 mg/mL），繼續培養4 h，棄上清，加150 μL DMSO溶解，將96孔板置于37℃恒溫震蕩培養器內震蕩10 min，使紫色結晶完全溶解。酶標儀490 nm波長處測定吸光度。

1.6RT-PCR法檢測細胞 Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達

1.6.1總RNA提取細胞總RNA的提取按照試劑盒說明操作。引物設計合成：由上海生工生物工程技術服務有限公司完成設計與合成，以β-actin為內參，引物序列信息見表1。

表1　引物序列

1.6.2PCR擴增 在冰浴離心管中依次加入樣品cDNA 1.5 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTP 2.5 μL、MgC121.3 μL、Taq酶0.1 μL、上游引物和下游引物各0.5 μL、ddH2O 16.1 μL，使管中終體積達到25 μL，將離心管放入PCR擴增儀上，PCR擴增程序如下：條件：94℃變性30 s（β-actin 50℃、Bc1-2 46℃、Bax 45℃、Caspase-3 48℃）、退火40 s，72℃延伸50 s，共35個循環；最后72℃延伸10 min。

1.6.3結果分析 采用ge1-pro凝膠分析軟件對電泳譜帶進行積分光密度（IOD）分析，得出各條帶IOD值，用校正值 （Bc1-2/β-action、Bax/β-action、Caspase-3/ β-action）表示mRNA水平。

1.7Western blot檢測馬錢苷對Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達

1.7.1蛋白樣品制備 當細胞呈80%以上融合時，WIP組織細胞裂解液（PMSF終濃度為1 mmo1/L）提取總蛋。SDS-PAGE電泳：按照BIO-RAD公司說明書安裝SDS聚丙烯酰氨凝膠玻璃板，加樣照實驗分組將預染蛋白Marker和等體積的蛋白樣品30 μL注入到對應的膠孔中，連接電泳儀，100 V，電泳90 min。轉膜封閉：接通電源10 V，30 min將蛋白轉至經甲醇5 min和去離子水2 min浸泡后的PVDF膜，室溫置搖床封閉2 h。一抗孵育反應，1∶300稀釋小鼠抗β-actin單克隆抗體，1∶100稀釋Bax、Bc1-2 Caspase-3兔抗人單克隆抗體，脫色搖床上室溫孵育PVDF膜1 h后，4℃過夜。1∶10 000稀釋HRP標記羊抗小鼠二抗和HRP標記羊抗兔二抗，搖床孵育PVDF膜1 h后，顯影：ECL顯影液顯影。

1.7.2結果分析采用Lane ID凝膠分析系統對條帶進行IOD分析，得到各條帶的灰度值，以靶條帶的灰度值與內參的灰度值的比值來反映目的蛋白的表達水平。

1.8統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1馬錢苷對A375細胞活性的影響

試驗結果顯示，馬錢苷對A375細胞增殖具有明顯的抑制作用，在同一處理條件下，馬錢苷組對A375細胞活性的抑制影響與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）（圖1A）；另外，其抑制率分別在24、48、72 h時隨劑量依次增大，在一定程度上存在時間效應和劑量效應（圖1B）。計算得出，馬錢苷在作用48 h時的IC50為（74.96± 7.92）ng/mL。

圖1　馬錢苷對A375細胞活性和增殖的影響

2.2馬錢苷對Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達的影響

試驗結果顯示，馬錢苷能下調A375細胞Bc1-2 mRNA的表達，同時上調Bax和Caspase-3 mRNA的表達，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）（表2）；另外，藥物作用48 h時，隨藥物劑量依次增大，其對Bc1-2、Bax、Caspase-3 mRNA的調節作用越明顯，在一定程度上存在劑量效應（圖2）。

表2 不同組別的A375細胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA的相對表達量（±s，n=4）

表2 不同組別的A375細胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA的相對表達量（±s，n=4）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別　Bc1-2/β-actin Bax/β-actin　Caspase-3/β-actin空白對照組馬錢苷組（20 ng/mL）馬錢苷組（40 ng/mL）馬錢苷組（60 ng/mL）0.654±0.061 0.622±0.048*0.506±0.047**0.396±0.036**0.253±0.018 0.288±0.042*0.389±0.046**0.486±0.036**0.236±0.019 0.303±0.038**0.418±0.030**0.515±0.065**

圖2　馬錢苷對A375細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA的影響

2.3馬錢苷對Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的影響

試驗結果顯示，馬錢苷能下調A375細胞Bc1-2蛋白的表達，同時上調Bax和Caspase-3蛋白的表達，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）（表3）；另外，藥物作用48 h時，隨藥物劑量依次增大，其對Bc1-2、Bax、Caspase-3蛋白的調節作用越明顯，在一定程度上存在劑量效應（圖3）。

圖3　馬錢苷對A375細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達的影響

表3　不同組別的A375細胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的相對表達量（±s，n=4）

表3　不同組別的A375細胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的相對表達量（±s，n=4）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別　Bc1-2/β-actin　Bax/β-actin　Caspase-3/β-actin空白對照組馬錢苷組（20 ng/mL）馬錢苷組（40 ng/mL）馬錢苷組（60 ng/mL）0.554±0.045 0.506±0.011*0.450±0.030**0.320±0.009**0.215±0.016 0.264±0.011*0.363±0.017**0.434±0.015**0.251±0.024 0.335±0.015**0.644±0.023**0.750±0.011**

3　討論

凋亡是細胞的程序性死亡，是由基因調控的腫瘤細胞的生長。腫瘤細胞的增長是由細胞增殖與凋亡的比例決定的。細胞凋亡是由多種信號蛋白通過多種途徑傳導的復雜過程，目前主要是通過死亡受體途徑（外部途徑）和線粒體途徑（內部途徑）實現的［5］。凋亡因子Bax、Bc1-2、Caspase-3與線粒體凋亡途徑密切相關［6-8］。Bax是Bc1-2家族促凋亡亞家族的代表，定位于細胞漿中，可提高凋亡敏感性，促進細胞凋亡。當細胞內Bax表達較多時，Bax能自身形成同源二聚體［9］，其能不斷引起線粒體的膜電位降低，進一步促進cyt-c 和AIF的釋放，cyt-c與凋亡酶激活因子（Apaf-1）、ATP 及pro-Caspase-9形成凋亡復合體，通過pro-Caspase-9的自身酶切活化，激活Caspase-9，進一步活化Caspase-3，引起細胞DNA裂解而凋亡［10-11］。Bc1-2是Bc1-2家族抗凋亡亞家族的代表［12］，主要定位于線粒體膜、內質網膜及核膜上，其主要功能為延長細胞壽命，研究提示Bc1-2基因在腫瘤組織中過量表達，并與腫瘤的發生發展密切相關［13］，當Bc1-2表達增多時，Bc1-2與Bax形成異源二聚體，引起細胞核谷胱甘肽積聚，導致核內氧化還原平衡的改變，阻止胞內Ca2+流動，導致線粒體膜的通透性改變，干擾了線粒體膜釋放cyt-c，抑制Caspase-3依賴的線粒體蛋白水解級聯反應，從而起到抑制細胞調亡的作用［14-15］，可見Bc1-2和Bax蛋白均位于線粒體上游，是Caspase-3依賴的線粒體途徑的重要調控因素［16-19］。部分機制雖是如此，但只有當Bax/Bc1-2值升高，才可認為是Bax真正意義上的表達增多，才是Bax形成同源二聚體促使凋亡的條件［20］。

本研究顯示，馬錢苷能顯著下調Bc1-2的mRNA和蛋白質表達，同時上調Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白質表達，并且隨著給藥濃度的增大，Bax/Bc1-2值愈大，對A375的抑制作用愈強，與空白對照組比較，具有顯著性差異。因此推斷，馬錢苷可能通過下調Bc1-2 mRNA和蛋白質表達，上調Bax mRNA和蛋白質表達，提高Bax/Bc1-2值，促進cyt-c釋放，激活Caspase-3依賴的線粒體途徑誘導A375細胞凋亡。這可能是馬錢苷抑制惡性黑色素瘤細胞A375增殖的作用機制，這將為治療人惡性黑色素瘤新藥的開發提供一種可能。

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Study on the inhibitory effect and molecular mechanism of loganin on human malignant melanoma cells

DANG WenjunCHEN JinghuaZHANG NingWANG Jiazhi HUANG Xinhong
Hei1ongjiang University of Chinese Medicine，Hei1ongjiang Province，Harbin150040，China

R739.5

A

1673-7210（2016）04（c）-0015-05

黑龍江省自然科學基金面上項目（D201275）。

黨文軍（1986-），男，黑龍江中醫藥大學臨床醫學院2013級中醫外科學專業在讀碩士研究生；研究方向：中醫外科學中醫藥美容。

陳景華（1965-），女，碩士，教授，碩士研究生導師，主要從事中醫外科學中醫藥美容研究。

2016-01-02本文編輯：張瑜杰）