HPLC法測定硫酸氫氯吡格雷有關物質

吳相永

摘 要：建立高效液相色譜法測定硫酸氫氯吡格雷有關物質的方法。根據文獻資料[4，5]，采用高效液相色譜法，以手性色譜柱，建立了硫酸氫氯吡格雷的有關物質測定方法，方法簡便，準確。采用ULTRONES-OVM（Analytical）手性柱（150mm×4.6mm，5μm），色譜填料為L57。以0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈（75∶25）為流動相，檢測波長為220nm。硫酸氫氯吡格雷和雜質B1之間的分離度大于2.5，符合要求。本方法具有簡便、快捷、準確、靈敏和專屬性強的特點，符合本品有關物質的測定要求。

關鍵詞：高效液相色譜法；硫酸氫氯吡格雷；有關物質測定

1 引言

硫酸氫氯吡格雷（Clopidogrelhydrogensulfate）是一種血小板聚集抑制劑，臨床上用于預防和治療因血小板高聚集狀態引起的心、腦及其他動脈的循環障礙疾病[1-3]。由法國Sanofi-Aventis原研，1998年美國上市，2001年在我國批準上市，商品名波立維（ Plavix）。根據文獻資料[4，5]，采用高效液相色譜法，以手性色譜柱，建立了硫酸氫氯吡格雷的有關物質測定方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試藥

儀器 安捷倫1100高效液相色譜儀帶二極管陣列檢測器

ULTRONES-OVM手性色譜柱（ 15cm×4.6mm，5μm）

梅特勒-托利多MX205分析天平

試藥 硫酸氫氯吡格雷對照品（ 中國藥品生物制品檢定所），批號：100819-200601

雜質A：USP對照品（批號：G0H250），用于雜質定量分析。

雜質B：USP對照品（批號：G1H047），用于雜質定量分析。

雜質C：USP對照品（批號：F2H215），用于雜質定量分析。

2.2 方法的建立

2.2.1檢測波長的選擇

將本品、雜質A、雜質B和雜質C制成適當溶液后進行紫外掃描，結果本品和已知雜質的紫外吸收行為類似，均在270nm、277nm和低波長附近處有最大吸收。由于多數物質在低波長處均有吸收，且本品與已知雜質的低波長區吸收強度遠高于270nm，因此為更多的檢出未知雜質，同時參考USP31版中硫酸氫氯吡格雷測定的檢測波長220nm，選擇低波長220nm作為有關物質的測定波長。

2.2.2色譜條件的確定

參考國家標準（WS1-（X-471）-2003Z）[4]和USP31版藥典[5]的有關物質檢測方法，并進行了對比研究，最終選擇了本品的有關物質檢測條件：采用ES-OVM柱；以0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈（75：25）為流動相；檢測波長：220nm；進樣量：10μl；流速：1.0ml/min。

2.2.3系統適用性試驗

按上述色譜條件進行試驗，取雜質對照品溶液進樣，記錄色譜圖，出峰順序分別為雜質A、雜質B第一個異構體（雜質B1）、硫酸氫氯吡格雷、雜質B第二個異構體（雜質B2）和雜質C；取系統適用性試驗用溶液進樣，雜質B第一個異構體與硫酸氫氯吡格雷分離度不小于2.5，實際測得結果為3.3。

2.3 方法學驗證與結果

2.3.1專屬性試驗

分別量取溶劑空白、未破壞樣品、酸破壞、堿破壞、熱破壞、光破壞溶液各10μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果本品在酸、堿、熱及強光照射條件下均有不同程度的破壞，新增大的降解峰主要為雜質A和雜質C，并且與硫酸氫氯吡格雷峰分離良好，可知本方法專屬性高，適合對本品有關物質的檢測。

2.3.2最低檢測限、定量限

取硫酸氫氯吡格雷對照品、雜質A、雜質B和雜質C貯備液各適量，分別加流動相稀釋至峰響應值約為基線噪音水平3倍、10倍的濃度，精密量取各供試液10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算最低檢測限和定量限。結果見表1。

2.3.3進樣精密度試驗

取雜質對照品溶液，連續進樣6次，考察雜質A、雜質B1、硫酸氫氯吡格雷和雜質C的峰面積變化情況，結果雜質A、雜質B1、硫酸氫氯吡格雷和雜質C峰面積的RSD分別為3.0%、3.3%、1.8%、2.8%，RSD均小于10，說明本方法進樣精密度良好，符合雜質定量測定的要求。

2.3.4重復性試驗

取本品約100mg，精密稱定，置200ml量瓶中，用甲醇5.0ml溶解后加流動相稀釋成至刻度，搖勻，作為供試品溶液。分別配制6份供試品溶液，各精密量取10μl進樣分析，以外標法計算已知雜質的量，考察測定結果的相對標準偏差，結果雜質A、雜質B1、雜質C峰面積的RSD分別為3.9%、5.4%、1.8%，均小于10%，說明本法重復性良好。

2.3.5線性試驗

分別精密量取硫酸氫氯吡格雷對照品、雜質A、雜質B和雜質C貯備液適量，加流動相逐級稀釋，得硫酸氫氯吡格雷、雜質A、雜質B1和雜質C的線性試驗溶液。精密量取各溶液10?l分別進樣，記錄色譜圖。

以峰面積A為縱坐標、濃度c為橫坐標做線性回歸，得雜質A、雜質C、硫酸氫氯吡格雷、雜質B1的曲線分別為：A = 21.365c -1.4165，r=0.9981，A = 15.156c-0.2251，r=0.9979，A = 17.724c + 3.8769，r=0.9995，A = 19.711c -0.1161，r=0.9995。試驗結果表明雜質A在濃度0.41～4.88μg/ml，雜質B1在濃度0.6～11.46μg/ml，雜質C在濃度3.43～12.21μg/ml，硫酸氫氯吡格雷在濃度0.36～3.98μg/ml范圍內，濃度與峰面積呈良好的線性關系。

2.3.6回收率試驗

采用加樣回收的方法對雜質A、B和C進行了回收率試驗研究。

雜質A對照品母液的配制：取雜質A適量，用甲醇溶解并稀釋至每1ml含雜質A約40μg的溶液，即得。

雜質B對照品母液的配制：取雜質B適量，用甲醇溶解并稀釋至每1ml含雜質B約120μg的溶液，即得。

雜質C對照品母液的配制：取雜質C適量，用甲醇溶解并稀釋至每1ml含雜質C約200μg的溶液，即得。

供試品溶液的配制：取本品約100mg，置200ml量瓶中，加甲醇5.0ml溶解后加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為樣品貯備母液；取5ml，置10ml量瓶中，分別加雜質A對照品母液、雜質B對照品母液和雜質C對照品母液各0.8ml、1.0ml和1.2ml，得含有80%、100%和120%雜質的供試品溶液，每份各平行配制三次。

精密量取上述供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以外標法計算加入雜質的含量，計算回收率及相對標準偏差，結果雜質A、雜質B1、雜質C回收率分別為106.7%、106.1%、101.6%，RSD分別為4.4%、5.8%、2.7%。由上述試驗結果可知，雜質A、雜質B1和雜質C的回收率良好，均在80%～120%之間，且RSD%均小于10，滿足已知雜質定量測定的要求

2.3.7耐用性試驗

在確定的有關物質測定方法的基礎上，分別考察了流動相比例變化±5%、柱溫變化±5℃和流速變化±0.2 ml/min對有關物質測定結果的影響。試驗結果表面，當溫度、流速和流動相比例發生略微改變時，有關物質的測定結果基本不受影響。

2.3.8有關物質測定的溶液穩定性

取本品約100mg置200ml量瓶中，加甲醇5.0ml溶解后加流動相稀釋成至刻度，搖勻，室溫下放置，分別于0、2、4、8小時進樣測定，記錄色譜圖。結果表明本品的有關物質溶液在8小時內基本穩定，滿足分析測定的需要。

3 討論

3.1 本文采用手性色譜柱，能使主成分及各雜質有效分離，結果準確可靠，滿足測定要求；

3.2本法測定硫酸氫氯吡格雷有關物質， 專屬性強， 結果準確、 靈敏、 快速。為硫酸氫氯吡格雷的質量控制提供了值得借鑒的方法。

參考文獻

[1]袁靜.氯毗格雷的藥理學、臨床療效和耐受性[J].中國臨床藥學雜志，1999，8（4）：69—70.

[2]Mitakos A，PandenL.A Validated LC Method for theDetermination of Clopidogrel in Pharmaceutical Preparations[J].J.Pharm Biomed Anal.， 2002， 28（3）： 431—438.

[3]孫立平，張林潮.氯吡格雷在冠心病中的應用[J].醫學綜述， 2006， 12（19）： 1190— 1192.

[4]國家藥典委員會.新藥轉正標準硫酸氫氯吡格雷[S].WS1-（X-471）-2003Z，北京：化學工業出版社，2003.

[5]美國藥典委員會.美國藥典[M/CD].第32版，美國：美國光盤發行社，2008.