胎牛血清對人內皮細胞HMEC-1體外成血管實驗影響的觀察△

胡雅瓊　林渺滿　林　凡（福建中醫藥大學中西醫結合學院　福州　350122）

胎牛血清對人內皮細胞HMEC-1體外成血管實驗影響的觀察△

胡雅瓊林渺滿林凡（福建中醫藥大學中西醫結合學院福州350122）

目的：觀察胎牛血清對人內皮細胞HMEC-1體外成血管實驗的影響。方法：人內皮細胞HMEC-1采用相同的培養條件處理后，隨機分為無胎牛血清組和胎牛血清組，分別采用無胎牛血清培養基和含胎牛血清培養基（含5%胎牛血清）接種于成血管基質膠，培養6h后用倒置相差顯微鏡觀察不同處理組內皮細胞血管管腔形成情況。結果：無胎牛血清組的血管管腔數明顯多于胎牛血清組（P＜0.05）。結論：提示在體外成血管實驗中無胎牛血清的條件有利于內皮細胞毛細血管樣結構的形成。

HMEC-1細胞 胎牛血清 體外成血管

血管新生是機體從已有的毛細血管或毛細血管后靜脈發展形成新血管的過程，對于腫瘤生長、轉移，以及冠心病等缺血性疾病治療有著重要意義。隨著這些疾病日益危害人類的健康，血管新生研究領域受到越來越多的關注，有關血管新生的實驗方法不斷發展。血管新生的過程涉及血管內皮細胞的增殖、遷移、芽生、分裂和分支以及新的毛細血管網的形成。因此，毛細血管網的形成是內皮細胞血管形成能力的最終體現。自從國外的研究者們發現血管內皮細胞在體外培養條件下具有形成毛細血管樣結構的能力，內皮細胞體外成血管實驗被廣泛應用于血管新生研究［1～3］。但對于內皮細胞體外成血管實驗條件的研究還有一些盲點。胎牛血清是細胞體外培養過程中的重要培養基添加劑，為細胞體外生長提供必需的營養物質和各種因子等。胎牛血清的添加是否影響內皮細胞的體外成血管能力？我們針對上述問題進行了研究，以期優化內皮細胞體外成血管實驗方法，推動研究的開展。

1材料與方法

1.1主要材料與試劑：人微血管內皮細胞（human microvascular endothelial cells，HMEC-1）由本實驗室培養并保存，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，購自美國Gibco公司），MCDB-131細胞培養基（由美國Sigma公司生產），表皮細胞生長因子（Epidermal Growth Factor，EGF，購自美國Peprotech公司），氫化可的松（購自BioBasic公司），碳酸氫鈉（購自上海生工生物工程有限公司），0.25%胰蛋白酶（購自美國Hyclone公司），體外成血管試劑盒（In Vitro Angiogenesis Assay Kit，購自美國Millipore公司）。

1.2細胞培養與分組處理

1.2.1細胞培養：HMEC-1細胞采用MCDB-131培養液（含10ng/ mL EGF、1μg/mL氫化可的松，10%FBS）于5%CO2，37℃常規培養。取對數生長期的細胞經0.25%胰蛋白酶消化收集，制成單細胞懸浮液后，以20×104個/孔的密度接種于6孔板。細胞經24h同步化后以含5%FBS MCDB-131培養基培養48h。

1.2.2鋪設基質膠：根據In Vitro Angiogenesis Assay Kit試劑盒說明書進行操作，將基質膠稀釋液與基質膠按1∶9的比例混勻后，置于冰上按50μL/孔加入預冷的96孔板中，鋪平膠面后，置于37℃、5%CO2培養箱中孵育1h。

1.2.3細胞分組及體外成血管：將貼壁培養的HMEC-1細胞采用0.25%胰蛋白酶消化收集后，制成單細胞懸液，隨機分為胎牛血清組（5%FBS）和空白胎牛血清組（0%FBS）。然后將各組細胞懸液稀釋至16×104個/mL的密度，按毎孔150μL重新接種于鋪有成血管基質膠的96孔板中，于37℃、5%CO2培養箱中培養6h后，觀察細胞出芽相互連接形成的管腔樣結構，在200倍相差倒置顯微鏡下取6個視野拍照（倒置熒光顯微鏡系統，德國Leica公司），計數管腔形成數。

1.3統計學方法：本實驗所得數據采用SPSS16.0軟件獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2結果

在體外成血管實驗中，內皮細胞在基質膠上生長一段時間后出芽形成管腔。形成的管腔數可反映細胞的體外成血管能力。圖1顯示，空白胎牛血清組的血管管腔數明顯多于胎牛血清組（P＜0.05），而且管腔更大，結構更復雜，提示在體外成血管實驗中無胎牛血清的條件有利于內皮細胞毛細血管樣結構的形成。

3討論

內皮細胞體外成血管實驗能夠有效評價某種特定因素對血管生成的影響，是體外血管新生研究的常用方法。一些實驗研究表明，影響內皮細胞體外成血管的因素眾多。本課題組的前期研究也發現，不同實驗條件對體外成血管有較大影響。胎牛血清含有細胞生長必需的營養成分和一些生長因子，在細胞體外培養中起著至關重要的作用，亦可能是內皮細胞體外成血管實驗的重要影響因子。本研究通過觀察胎牛血清對人微血管內皮細胞（HMEC-1）體外成血管實驗的影響，發現在胎牛血清存在或不存在的條件下，HMEC-1細胞均能在基質膠上形成血管管腔樣結構。但是相對于5%濃度的胎牛血清培養基，采用無胎牛血清的培養基接種細胞至基質膠上形成的血管管腔數量更多，管腔更大，結構更復雜，提示不含胎牛血清的培養基有利于HMEC-1細胞形成血管管腔結構，這與其他研究者結論類似［4～6］。胎牛血清含有的物質大多來自母體，主要成分為多肽、蛋白質和激素。其中一些物質如促細胞增殖因子可促進細胞增殖，胰島素有助于內皮細胞分析，氫化可的松能促進細胞增殖。因此，本研究的體外成血管過程中，胎牛血清的缺失可能抑制了人內皮細胞HMEC-1的增殖，從而有利于誘導內皮細胞分化和遷移，進而更容易形成毛細血管樣結構［4］。這些結果為HMEC-1細胞體外成血管實驗方法的優化提供了有效依據，有利于相關實驗的順利進行。

［1］Folkman J and Haudenschild C.Angiogenesis in vitro［J］. Nature，1980，288：551-556.

［2］Maciag T，Kadish J，Wilkins L，et al.Organizational behavior of human umbilical vein endothelial cells［J］.J.Cell.Biology，1982，94：511-520.

［3］Feder J，Marasa JC，and Olander JV.The formation of capillary-like tubes by calf aortic endothelial cells grown in vitro ［J］.J Cell Physiol，1983，116：1-6.

［4］Liu J，Wang XB，Park DS，et al.Caveolin-1 expression enhances endothelial capillary tubule formation［J］.J Biol chem. 2002 Mar 22，277（12）：10661-10668.

［5］Vailhe B，Lecomte M，Wiernsperger N，et al.The formation of tubular structures by endothelial cells is under the control of fibrinolysis and mechanical factors［J］.Angiogenesis，1998，2（4）：331-344.

［6］宋軼鵬，姜翠芳.ECV304細胞二維培養形成毛細血管樣結構的觀察［J］.首都醫藥，2006（10）：35-36.

R329

B

1672-8351（2016）08-0111-02

國家自然科學基金項目（81102844），福建省自然科學基金項目（2016J01389），福建中醫藥大學校管項目（X2013021），國家級大學生創新訓練項目（201510393003）。