ZNF451和TGF-β在胃癌中的表達及其與臨床病理特征及預后的相關性研究

戎瑞洲韓志偉李曙晶張燕燕董金垚郭建昇

ZNF451和TGF-β在胃癌中的表達及其與臨床病理特征及預后的相關性研究

戎瑞洲①韓志偉①李曙晶①張燕燕①董金垚①郭建昇①

目的：探討鋅指轉錄因子451（ZNF451）在胃癌發生、發展過程中的作用及其與血管內皮生長因子（TGF-β）的相關性。方法：用組織芯片和免疫組織化學法檢測144例胃癌組織及對應癌旁組織中ZNF451、TGF-β的表達。結果：ZNF451在胃癌中陽性表達率為71.5%，高于癌旁組織的18.8% （P<0.01）；TGF-β在胃癌中陽性表達率為79.9%，高于癌旁組織的9.1%（P<0.01）。ZNF451和TGF-β表達均與胃癌分化程度、浸潤深度、有無淋巴結轉移和TNM分期相關（P<0.05）；胃癌組織中ZNF451表達和TGF-β表達正相關（P<0.05）。單因素生存分析顯示，ZNF451和TGF-β高表達均與生存時間呈負相關（P<0.05）。Cox多元回歸分析提示，ZNF451陽性胃癌和TGF-β陽性胃癌的預后更差（P<0.05）。結論：ZNF451在胃癌組織中高表達，并可能與TGF-β在胃癌的發生和發展過程中起協同作用，ZNF451結合TGF-β可作為胃癌預后的預測因子。

胃癌； 免疫組織化學； ZNF451； TGF-β； 預后

First-author’s address：The First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

目前，就全球而言胃癌（gastric carcinoma，GC）以占各種惡性腫瘤的第二位和第三位的發病率和死亡率成為了最常見的消化道惡性腫瘤，并且其差的預后不僅對人民的生命健康構成了重大的威脅還給人們造成了沉重的經濟負擔[1]，我國作為一個欠發達的發展中國家，這種情況愈發的明顯[2]。目前，在諸多治療胃癌的手段方法中，手術是有明確的療效的值得肯定的治療策略[3]，但是大多數患者因胃癌早期癥狀不明顯在就診時即確診為進展期胃癌，錯失手術良機并不能達到滿意的治療效果。因此，進一步研究胃癌發生發展的分子學機制，開發新的靶向治療的靶點，對手術治療進行進一步的補充顯得極為重要且迫切[4]。研究發現，ZNF451在細胞的生長增殖過程中起著不同的作用，一方面其能通過減弱TGF-β信號通路從而對細胞的生長起到阻滯效應；另一方面其直接抑制E-cadherin在細胞中的表達從而使得上皮細胞具有向間充質細胞轉變的傾向[5]。TGF-β在腫瘤發生發展的過程中起著雙面的作用，在早期它能夠通過抑制細胞生長從而起到抑癌基因的作用，在腫瘤進程的后期TGF-β具有促進腫瘤的侵襲和轉移的作用，使患者的預后變得更差[6]。目前尚未有對ZNF451在胃癌發生發展中作用的研究，本文采用免疫組化法檢測ZNF451 和TGF-β在胃癌組織中的表達情況，通過對兩者的表達情況與胃癌臨床病理特征進行統計學分析，從而期望能在胃癌的分子學機制與靶向治療方面做出貢獻。

1　材料與方法

1.1材料 選取2010年1月-2013年12月本院行胃癌根治術、術后病理診斷明確、臨床資料完整的、術前未行放化療的術后石蠟標本作為研究對象，通過對HE切片的復閱，選取癌組織及對應的癌旁組織144例，所有病例病理報告均為腺癌。其中，男111例，女33例；年齡>60歲組67例，≤60歲組77例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期50例，Ⅲ～Ⅳ期94例；有淋巴結轉移者107例，無淋巴結轉移者37例。

1.2主要試劑 ZNF451 antibody （Sigma），兔抗人TGF-β抗體（武漢博士德生物工程有限公司），羊抗鼠/兔二抗（福州邁新生物技術開發有限公司），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.3免疫組織化學

1.3.1組織芯片制備 使用組織芯片蠟塊制備儀（CHLOE，北京）制備受體蠟塊，按照實驗設計采用10×6陣列（間距1 mm、內徑2.2 mm）。按病理號調取所有HE染色玻片，鏡下復讀并于病變典型部位做一記號標記，然后在供體蠟塊上相應位置做標記，使用配套的取樣套針穿刺取材，并將獲得的組織芯小心地注入受體蠟塊孔內，于受體蠟塊的右下角兩個孔留空白以供定位之用。制備好的組織芯片常規4 μm厚連續切片，將其敷貼于免疫組化專用載玻片上，恒溫箱烤片，70 ℃過夜。

1.3.2免疫組織化學染色 將過夜烤片的切片按實驗步驟過缸，分別進行脫蠟，水化，消除內源性過氧化物酶，使用PBST漂洗后進行高溫高壓熱修復，冷卻至室溫，滴加一抗（ZNF451抗體濃度1∶200，TGF-β抗體濃度1∶200）4 ℃過夜，PBST漂洗，加入羊抗鼠/兔二抗，37 ℃孵育20 min，PBST漂洗行DAB顯色，鏡下觀察顯色程度，及時以自來水中止顯色反應，蘇木素復染3 min，鹽酸乙醇分化，脫水后中性樹膠封片保存。以PBS作陰性對照。

1.3.3結果判斷標準 每張切片高倍鏡下隨機選取5個視野，觀察并記錄細胞染色強度：細胞無顯色0分；細胞淺黃色，1分；細胞棕黃色，2分；細胞黃褐色，3分。記錄陽性細胞占腫瘤實質細胞的百分比：陽性細胞數占腫瘤實質細胞≤25%，1分；25%<陽性細胞數占腫瘤實質細胞≤50%，2分；50%<陽性細胞數占腫瘤實質細胞≤75%，3分；陽性細胞數占腫瘤實質細胞>75%為4分。陽性細胞比例與細胞染色強度計分的乘積為每例標本的最終積分。<3分為陰性（-），≥3分為陽性（+）。所有切片染色結果均由兩名病理醫師獨立評分。

1.4隨訪 以手術日為隨訪起始日期，以患者死亡或隨訪截止日期（2015年10月1日）為隨訪終點，通過查閱患者復診情況、電話聯系等方式進行。隨訪時間長度21～70個月，中位隨訪時間45個月，共隨訪94例，隨訪率65.3%。

1.5統計學處理 運用SPSS 20.0統計學軟件處理數據，計數資料采用x2檢驗，同時采用Spearman秩相關分析、Kaplan-Meier生存分析、Log-rank檢驗、Cox回歸分析法等方法進行統計學分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1胃癌組織、對應癌旁組織中ZNF451和TGF-β的表達 ZNF451蛋白在胃癌（圖1A）、癌旁組織（圖1B）中均有不同程度的表達，表達信號為棕黃色，定位于細胞質。胃癌組織和癌旁組織ZNF451蛋白陽性表達率分別為71.5%（91/144）、18.8% （27/144），比較差異有統計學意義（x2=80.9，P<0.001）；胃癌組織中ZNF451的表達水平明顯高于其對應的癌旁組織。TGF-β蛋白在胃癌（圖1C）、癌旁組織（圖1D）中均有不同程度的表達，表達信號為棕黃色，定位于細胞質。胃癌組織和癌旁組織TGF-β蛋白陽性表達率分別為79.9% （115/144）、9.1%（13/144），比較差異有統計學意義（x2=146.3，P<0.001）；胃癌組織中TGF-β的表達水平明顯高于其對應的癌旁組織。

2.2胃癌組織中ZNF451和TGF-β的表達與相關臨床參數的關系 胃癌組織ZNF451表達在腫瘤TNM分期、淋巴結轉移、浸潤深度、腫瘤大小中的差異均有統計學意義（P<0.05），年齡、性別、分化程度中的差異均無統計學意義（P>0.05）。TGF-β表達在腫瘤TNM分期、淋巴結轉移、浸潤深度、腫瘤大小中的差異有統計學意義（P<0.05），年齡、性別、分化程度中的差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.3胃癌組織中ZNF451和TGF-β的表達的相關性 103例ZNF451陽性的胃癌組織中有89例TGF-β表達陽性，14例TGF-β表達陰性；115例TGF-β陽性的胃癌組織中有89例ZNF451表達陽性，26例ZNF451表達陰性。Spearman相關分析顯示，ZNF451和TGF-β高蛋白表達的相關性有統計學意義，兩者表達呈正相關（r=0.259，P=0.002）。

2.4胃癌生存預后的Cox多元回歸分析 將與生存相關的各項指標均納入單因素分析，結果提示：腫瘤TNM分級、腫瘤大小、淋巴結轉移、浸潤深度與患者生存期相關，ZNF451和TGF-β高表達均與生存時間呈負相關（P<0.05）。將上述臨床病理因素和ZNF451、TGF-β均納入Cox比例風險模型進行多因素分析，結果顯示：腫瘤TNM分級（RR=10.519）、ZNF451（RR=0.083）、TGF-β （RR=0.326）均為獨立危險因素，見表2。

圖1　ZNF451和TGF-β蛋白在胃癌和癌旁組織中的表達（S-P，×200）注：圖A為胃癌組織中ZNF451表達；圖B為癌旁組織中ZNF451表達；圖C為胃癌組織中TGF-β表達；圖D為癌旁組織中ZNF451TGF-β表達

表1　ZNF451和TGF-β的表達與胃癌臨床病理參數之間的關系

表2　影響胃癌預后的多因素分析

3　討論

胃癌（gastric carcinoma，GC）因其高的發病率和死亡率而成為了一種常見的消化道惡性腫瘤[1]，據相關報告，全球每年有將近100萬的新發病的胃癌患者，其中我國約為40萬余，因胃癌死亡的患者約為80萬，我國有將近28萬，由此可見我國胃癌的發病率和死亡率之高[2]。概因胃癌的早期癥狀不典型，不易發現，確診時大多數為進展期，且由于化療的毒副作用及耐藥往往使晚期胃癌患者生存期更短，手術根治的機會少，因此需進一步研究其發病機制，為早期胃癌的鑒別診斷、術后跟蹤觀察和新的可能的靶向治療方案的靶點，亟需在早期診斷的方法和治療胃癌的技術方面取得新的進展[4]。

上皮細胞向間充質細胞轉化（EMT）是近年來細胞生物學領域的一大重大發現，這一過程在胚胎發育的過程、組織再生修復以及上皮細胞腫瘤惡變侵襲能力增強等方面都有起著重要的作用。EMT過程中存在著上皮細胞解離、重塑并向遠處遷徙的現象。許多不同種類的細胞因子參與到EMT早期的過程，導致了基質分子的降解。細胞自身表達的TGF-β、EGF、IGF-Ⅱ和FGF-2可以起到促進EMT過程的作用[7-8]。上皮細胞具有極性并且相互之間具有緊密連接的結構，在EMT的過程中，上皮細胞失去這些特點轉而具有了間充質細胞的特征，離開上皮細胞自身所在的區域并游離滲透進入周圍組織[9]，在上皮細胞EMT過程中，TGF-β信號通路起到了重要的作用，向培養的上皮細胞中（如MCF1OA，NMuMG和MDCK）加入TGF-β，使細胞培養的微環境中TGF-β濃度升高就能觀察到EMT現象的頻率明顯升高[10-11]。腫瘤的侵襲轉移是通過侵襲基質并突破基底膜實現的，細胞破壞了細胞間的粘連結構并浸潤到周圍組織是惡性腫瘤的特征[12]。

ZNF451屬于屬于鋅指蛋白家族成員，為近年來這一家族的新成員，該蛋白具有11個鋅指結構，其富含酸性氨基酸的N端和C端分別具有SIM及UIM特征結構域。有文獻報道，ZNF451定位于細胞核內亞結構PML（promyelocytic leukaemia）小體里，并通過SUMO化系統行使相關功能[13]。研究發現，ZNF451在細胞的生長增值過程中起著不同的作用，一方面其能通過減弱TGF-β信號通路從而對細胞的生長起到阻滯效應；另一方面其直接抑制E-cadherin在細胞中的表達從而使得上皮細胞具有向間充質細胞轉變的傾向，認為ZNF451可能在癌癥細胞的增殖、發展和遠處侵襲轉移的過程起著重要作用[5，13]。

TGF-β在腫瘤發生發展的過程中起著雙面且截然不同的相反的作用，在早期，它能夠通過抑制細胞生長從而抑制腫瘤發生起到抑癌基因的作用，在腫瘤發展的后期，TGF-β具有通過促進腫瘤細胞的侵襲和轉移的作用，而使得患者的預后變得更差。一方面，在體外實驗已經證實了TGF-β具有使腎細胞癌、甲狀腺癌等的進程延緩的作用[14-16]；研究發現部分TGF-β受體表達缺失的瘤細胞可以通過逃逸TGF-β介導的負性調控作用從而迅速增殖[17]。另一方面，高水平的TGF-β在乳腺癌中起到了促進癌細胞的浸潤與轉移的作用[18-19]；在裸鼠成瘤實驗中，向結腸癌細胞株中轉染TGF-β1反義寡核苷酸表達質?？山档推渲铝鲂訹20]；還有研究證實TGF-β1 高表達與胃癌患者的不良預后相關，其高表達與年輕患者、女性患者、遠端胃癌、低分化胃癌、彌漫型胃癌和淋巴結轉移患者的不良預后相關[21-23]。

目前關于ZNF451在胃癌發生演進中作用的研究未見報道，ZNF451對胃癌的影響及其與TGF-β作用有無相關性未見有相關報道，因此值得研究探討其在胃癌細胞及癌旁組織中的表達情況有無差異性，進一步研究ZNF451在胃癌的發生發展、浸潤及轉移過程中與TGF-β有無相關性，或可闡明它們之間的相互作用機制，找到針對特定或某個位點的關鍵靶點，為胃癌的臨床治療提供新的腫瘤標志物、治療思路或方案。實驗結果發現，與癌旁組織相比胃癌組織中ZNF451和TGF-β蛋白表達強度和表達率顯著升高。統計學分析發現，胃癌組織ZNF451蛋白表達與下列因素相關：（1）與腫瘤分期呈正相關，Ⅲ、Ⅳ胃癌中的表達明顯高于Ⅰ、Ⅱ期；（2）與TGF-β蛋白表達相關，可能與TGF-β蛋白在胃癌的發生發展中起協同作用；（3）與患者的生存期呈負相關，表達陽性患者生存期顯著低于表達陰性患者。上述結果表明其與胃癌的惡性生物學行為呈正相關，提示ZNF451具有促進腫瘤生長、侵襲的功能。因此認為檢測胃癌組織ZNF451和TGF-β表達可能預測胃癌的預后也可能從相同TNM分期的病例中區分出高危亞組和預后較好亞組，根據胃癌組織中ZNF451和TGF-β表達進行分類，更有助于區分術后高?；颊吆屯ㄟ^調控ZNF451的表達對TGF-β相關的信號轉導通路進行影響而改善預后。

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The Expression of ZNF451 and TGF-β in Gastric Cancer and Their Association with Clinicopathological and Prognostic Significance

RONG Rui-zhou，HAN Zhi-wei，LI Shu-jing，et al.

Medical Innovation of China，2016，13（23）：001-005

Objective：To investigate the correlation of the expression of zinc finger transcription factor 451 （ZNF451） and transforming growth factor beta （TGF-β） with the carcinogenesis and tumor progression in human gastric cancer. Method：Immunohistochemical method （SP） was used to detect the expression of ZNF451 and TGF-β protein in 144 cases human gastric cancer tissues and para-carcinoma tissues.Result：The positive rate of ZNF451 and TGF-βin gastric cancer tissues were 71.5%，79.9%，higher than that para-carcinoma tissues of 18.8%，9.1%（P<0.01）.The expressions of ZNF451 and TGF-β related to size of tumor，depth of invasion，TNM staging，and lymph node metastasis（P<0.05）.ZNF451 and TGF-βexpression in gastric cancer tissue had positive correlation（P<0.05）.Single factor survival analysis showed that ZNF451 and TGF-βhigh expression were negatively correlated with survival time（P<0.05）.The prognosis of ZNF451 positive gastric cancer and TGF-positive gastric cancer were even worse（P<0.05）.Conclusion：ZNF451 highly expresses in gastric cancer，and might promote the occurrence and progression of gastric cancer in correlation with VEGF.

Gastric； Cancer； ZNF451； TGF-β； Prognosis

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.23.001

①山西醫科大學第一醫院 山西 太原 030001

郭建昇

2016-03-28） （本文編輯：蔡元元）