免疫球蛋白重鏈基因重排檢測在原發性胃腸道B細胞非霍奇金淋巴瘤中的應用研究

姜黃　鄭麗華　楊金花

[摘要]目的探討多聚酶鏈反應（PCR）檢測免疫球蛋白重鏈基因重排在原發性胃腸道淋巴組織增生性疾病中的良惡性鑒別中的應用價值。方法選取存檔蠟塊45例，采用HE常規染色及SP免疫組化方法進行組織學分類，運用PCR半巢式擴增免疫球蛋白重鏈基因重排，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。結果IgH FR3A和IgH FR3A+FR2A在MALT淋巴瘤的陽性檢測率分別為60.7%（17/28）和75.0%（21/28），在DLBCL中的陽性檢測率分別為60.0%（9/15）和73.3%（11/15），在MCL中的陽性檢測率分別為100.0%（1/1）和100.0%（1/1）。IgH FR3A在胃腸道淋巴瘤中的陽性檢測率為60.0%。IgH FR3A聯合IgH FR2Ad在胃腸道淋巴瘤中的陽性檢出率為73.3%（33/45）。結論采用PCR方法檢測免疫球蛋白重鏈基因重排能夠作為淋巴瘤診斷的有效輔助手段，有助于對原發性胃腸道淋巴組織增生性疾病的良惡性做出正確的診斷。

[關鍵詞]胃腸道淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤；基因重排；多聚酶鏈反應；免疫球蛋白重鏈基因

[中圖分類號]R733

[文獻標識碼]A

[文章編號]2095-0616（2016）03-29-04

淋巴瘤是起源于淋巴組織及淋巴結的惡性腫瘤，原發性胃腸道淋巴瘤是結外淋巴瘤的最好發部分。原發性胃腸道淋巴瘤占結外淋巴瘤的30%～45%。原發性淋巴瘤由于其臨床表現無特殊性，尤其在早期的惡性淋巴瘤由于其更缺乏特異性，因此臨床較難做出正確診斷，易造成誤診。病理診斷淋巴瘤較為可靠，借助形態學和免疫組織化學能對大部分淋巴瘤做出明確的診斷，但對一些疑難病例仍然不能做出正確診斷，未能得到及時的正確診斷不利于臨床醫生做出最佳的治療方案和進行必要的預后評估。近年來，針對淋巴瘤免疫球蛋白重鏈（immunoglobulin heavy chain，IgH）基因重排檢測已經成為臨床上診斷淋巴瘤的一項必要手段，成為鑒別診斷淋巴瘤的一種新的有力工具，

本研究對此進行初步研究。

1.資料與方法

1.1一般資料

收集2008年10月～2014年10月鄭州人民醫院收治胃腸道B細胞非霍奇金淋巴瘤（Bcell non-Hodgkin lymphoma，B-NHL）45例，來自內鏡活檢和手術標本均經病理證實。男27例，女18例，年齡21-77歲（中位年齡52歲）。陽性對照為Raii細胞株，陰性對照為1例淋巴組織反應性增生。

1.2臨床表現

45例胃腸道B-NHL患者中出現腹痛37例（82.2%），腹脹10例（22.2），血便10例（22.2%），發熱8例（17.8%），腹部包塊7例（15.6%），黑便6例（13.3%），消瘦5例（11.1%），黏液便5例（11.1%），腹瀉2例（4.4%）。45例病變累及胃21例（46.7%），小腸2例（4.4%），回盲部3例（6.7%），結腸10例（22.2%），直腸3例（6.37%），小腸合并結腸1例（2.7%）。其中表現為淋巴結轉移26例（57.8%），未查見淋巴結轉移19例（42.3%）。

1.3方法

1.3.1免疫組化所有標本經中性福爾馬林固定、常規石蠟包埋、4-5um連續組織切片，除進行常規HE染色以外，采用免疫組化S-P法進行免疫表型標記：LCA（2B11，DAKO）、CD3（F7.2.38，DAKO），CD45RO（OPD4，DAKO）、CD20（L26，DAKO）、CDIO（MX002，DAKO）、CDl5（Carb-3，DAKO）、CD30（Ber-2、DAKO）、Bcl-2（SP66，DAKO）、Bcl-6（LN22，DAKO）、CyclinD-1（DCS-6，DAKO）、PAX-5（SP34，DAKO）、kappalight chain（L1C1，DAKO）

和lambda light chain（LAM03+HP6054，DAKO）標記輕鏈。依據不同免疫表型表達情況并根據2008年WHO淋巴及造血系統腫瘤分類標準對所有病例進行分類。

1.3.2組織分型常規HE制片，結合免疫組化結果，所有病例經由2位以上病理學專家共同閱片確診為非霍奇金B細胞淋巴瘤，其中胃腸道黏膜相關淋巴瘤（mucosa associated lymphoid tissuelymphoma，MALT）28例，彌漫大B細胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）15例，濾泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）1例，套細胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）1例。

1.3.3DNA提取及半巢式PCR反應石蠟組織10um連續切片5張，常規酚一氯仿法抽提DNA。采用半巢式PCR。一致性v區引物（FR2A）：5TGGA/GTC CGC/A CAG G/CCT/C T/CCN GG 3一致性V區引物（FR3A）：5ACA CGG C（C/T）（G/C）TGT ATT ACT GT 3，（J區引物）LJH：5TGAGGA GAC GGT GAC C 3，（J區引物）VLJH：5GTG ACC AGG GT（A/G/C/T）CCT TGG CCCCAG 3。進行半巢式反應，第一輪PCR用引物FR3A（FR2A）+LJH，其產物稀釋100倍作為模板，FR3A（FR2A）+VLJH進行第二輪PCR反應?？傮w積25uL：10×buffer 2.5uL，MgCl，1.8uL（終濃度1.8mM），dNTP 1.5uL（終濃度10uM），引物各0.2uL終濃度200nM），TaqPlus酶0.2uL（1u），模板DNA 1UL，體積不足部分雙蒸水補足。所有PCR反應均在94℃預變性6min，94℃變性lmin，55℃退火lmin，72℃延伸lmin，40個循環，反應結束后在72℃延伸10min，然后4～C放置。產物長度70-130bp。已知陽性病例做陽性對照，反應性淋巴組織增生做陰性對照，緩沖液做空白對照。擴增產物行2%瓊脂糖凝膠電泳。所需引物和試劑均購自上海生工公司。