高效液相法測定當歸補血丸中阿魏酸含量

周往

【摘要】 目的 建立高效液相法（HPLC）測定當歸補血丸中阿魏酸含量的方法。方法 采用HPLC測定當歸補血丸中的阿魏酸含量， C18柱：4.6 mm×250 mm， 5 μm；流動相采用甲醇-1.0%冰醋酸溶液。結果 阿魏酸在5.00～80.00 ?g/ml濃度范圍與峰面積具有良好的線性關系（r=0.9998）， 回收率為98.86%， RSD=1.13%。結論 采用HPLC測定當歸補血丸中的阿魏酸含量具有簡便、準確和靈敏的優勢， 可用于對當歸補血丸進行質量控制。

【關鍵詞】 當歸補血丸；高效液相法；阿魏酸

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.24.213

當歸養血丸主要是由當歸、黃芪、白芍與地黃等10味中藥組成， 具有養血、益氣與調經等功效， 臨床上多用于治療月經不調、氣血兩虛等疾病， 并且可獲得滿意的療效。2005年版《中國藥典》法定標準鐘僅對當歸顯微鑒別項目、丹皮薄層鑒別方法進行了收錄， 這對藥品的生產與使用質量造成一定的限制[1]?；诖?， 本研究參考相關文獻， 對高效液相法測定當歸補血丸中阿魏酸含量方法的建立進行了研究， 借以更好的控制藥物的質量。

1 儀器與試劑

1. 1 儀器 高效液相色譜儀， 型號為Thermo fisher U3000， 以及配套工作站（包括紫外與熒光檢測器等）；生產廠家：Thermo fisher；C18柱：4.6 mm×250 mm， 5 ?m；電子分析天平， 精密度為0.0001；紫外可見分光光度計， 型號為TU-1900。

1. 2 試劑 甲醇， 水為超純水， 其他試劑均為分析純。阿魏酸對照品生產批號為20131015， 生產廠家：中國藥品生物制品檢定所；當歸養血丸源于市場銷售同一生產廠家， 生產批號為140306、140501、140701、140901、141101。

2 方法與結果

2. 1 色譜條件選擇 采用HPLC高效液相色譜法對當歸補血丸中的阿魏酸含量， C18柱：4.6 mm×250 mm， 5 ?m；流動相采用甲醇-1.0%冰醋酸溶液， 比例為25：75；檢測波長為：320 mm；柱溫：25℃；流速1.0 ml/min。；進樣量10.0 μl。將阿魏酸峰值計算>3000作為理論塔板數。

2. 2 對照品溶液配制 精確稱取0.10 mg阿魏酸對照品， 將其置入5 ml的容量瓶中， 然后加入甲醇溶液定容， 靜置并作為備用。

2. 3 試驗樣品配制 采用電子天平準確稱取當歸養血丸10.0 g， 然后加入精確稱取的硅藻土10 g， 混勻后研細， 并將其置于提取器， 加入200 ml 70%甲醇溶液后提取， 提取時間為5 h， 將提取液壓縮到4 ml左右， 將殘渣采用流動相進行溶解并轉移（20 ml容量瓶）， 并加入流動相進行定容以備用。

2. 4 陰性樣品配制 采用電子天平精確稱取當歸樣品10.0 g， 然后根據“2.3試驗樣品配制”方法進行陰性樣品的配制。獲得的儲備液置于棕色容量瓶中。

2. 5 干擾試驗 取阿魏酸對照品溶液、試驗樣品溶液與陰性樣品溶液10 μl， 注入液相色譜儀后進行檢測， 獲得圖譜， 結果發現陰性對照品對本次試驗檢測并無影響。

2. 6 線性關系分析 精密吸取20 μg/ml濃度的阿魏酸對照品溶液置入2 ml容量瓶， 吸取體積分別為10、20、40、80、160和320 μl， 然后加入流動相定容， 分別吸取10 μl各濃度上述配制溶液注入到高效液相色譜儀中， 分別記錄各自峰面積， 縱坐標表示峰面積， 橫坐標表示進樣量， 繪制標準曲線回歸方程y=3.8642×104x+0.0538×104。結果顯示， 阿魏酸5.00～80.00 μg/ml濃度范圍與峰面積具有良好的線性關系（r=0.9998）。

2. 7 精密度分析 吸取10 μl試驗樣品溶液（來源于同一試樣）， 重復5次進樣， 測定其峰面積平均值， 測得RSD=1.13%。結果表明， 該方法具有良好的精密度。

2. 8 穩定性分析 吸取10 μl試驗樣品溶液（來源于同一試樣）， 分別于0、2、4、8、16、20、24 h進樣1次， 結果其RSD=0.94%， 表明阿魏酸24 h內是基本穩定的。

2. 9 重復性分析 取5份同一批號的樣品， 根據“2.3試驗樣品配制”方法制備樣品并對其阿魏酸含量進行測定， 參照線性結果， 樣品中阿魏酸平均值為0.052 mg/g， RSD=1.54%， 具有良好的重復性。

2. 10 回收率分析 稱取2.0 g左右同一批號（140901）已知阿魏酸含量樣品， 共稱取5份， 然后精密稱定， 并加入2.4 ml 0.05 mg/g阿魏酸對照溶液， 測定其回收率。結果測得， 樣品1～5號阿魏酸實測含量見表1， 阿魏酸回收率平均為98.86%， RSD=1.13%。

2. 21 樣品含量測定 取5個批號當歸養血丸試驗樣品， 制成待測溶液， 精密吸取10.0 μl供試樣品溶液與對照品溶液， 注入到高效液相色譜儀中進行阿魏酸含量測定， 結果顯示， 阿魏酸色譜峰與樣品雜質峰可實現基線分離， 理論塔板數>3000。5批試樣阿魏酸（140306、140501、140701、140901、141101）含量依次為：0.055、0.056、0.051、0.048、0.050 mg/g。

3 討論

阿魏酸是當歸養血丸中的一個主要成分， 穩定性不高， 在見光下容易發生分解， 因此阿魏酸對照品放置4 h后含量會出現下降， 因此在本次研究中采取了避光處理， 并在配制后及時使用[2]。制劑中阿魏酸含量在24 h內的變化并不明顯， 比較穩定[3]。

大量參考文獻關于流動相選擇主要考察了不同比例甲醇-0.1%磷酸溶液， 包括25：75、30：70、45：55， 但其分離效果并不佳， 樣品峰與雜質峰圍著無法完全分離。本次研究中采用的流動相為甲醇-1.0%冰醋酸溶液， 比例為25：75， 經考察發現用于測定當歸養血丸中阿魏酸含量具有良好的分離效果。在波長的選擇中， 作者選擇了200～400 nm位置的掃描， 結果發現， 檢測波長在320 nm時， 吸收峰最大， 干擾少， 因此將其作為本次檢測波長。2005年版《中國藥典》中當歸項中阿魏酸含量限度為0.05%[3]， 測定5個批次當歸養血丸中的阿魏酸含量， 其含量應>0.035 mg/g。

綜上所述， 本文中建立的高效液相色譜法測定當歸補血丸中的阿魏酸含量具有簡便、準確和靈敏的優勢， 測定方法穩定， 通過對樣品數據的反復考察， 該方法專屬性強， 可用于對當歸補血丸進行質量控制。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（一部）. 北京：化學工業出版社， 2005：89.

[2] 何玲玲. 高效液相色譜法測定當歸養血丸中阿魏酸含量. 中國醫藥導報， 2011， 8（3）：60-62.

[3] 付麗佳. 當歸補血丸中阿魏酸溶出度測定. 中國實驗方劑學雜志， 2013， 19（5）：144-146.

[收稿日期：2016-04-25]

【關鍵詞】 巨大兒；因素；研究

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.24.212

巨大兒是產科常見的胎兒并發癥之一， 是難產、新生兒產傷的高危因素。國內發生率約為7%， 國外發生率約為15.1%， 近年來有逐漸增加趨勢[1]。多年來臨床上采用各種方法力求提高胎兒出生體重估計的準確性， 但對胎兒出生體重的估計仍存在較大誤差[2]。因此， 對巨大兒的致病機理進行分析， 進而對圍產期的相關病理狀況進行評估， 及時提出恰當的預防治療方案。

1 巨大兒對母兒的影響

胎兒過大， 子宮壁張力增加， 收縮乏力， 腹部過度膨隆， 腹肌收縮無力， 給陰道分娩造成困難。肩難產處理不當， 可發生嚴重的軟產道損傷， 嚴重者還會出現子宮破裂的問題。目前分娩的過程中還有可能出現盆底組織的裂傷， 繼而導致子宮脫垂和陰道壁膨出現象， 還可引發尿瘺、糞瘺。巨大兒在分娩過程中， 容易造成新生兒窒息、部分巨大兒可能會終身肥胖， 同時巨大兒手術產率較正常胎兒明顯增高[3]。

2 發生巨大兒的危險因素

2. 1 妊娠期糖尿病 妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus， GDM）也即母體在妊娠期間存在的糖尿病癥狀， 包含了一部分妊娠前已患有糖尿病但孕期首次被診斷的患者。1997年世界衛生組織（WHO）將GDM列為糖尿病的一個獨立類型。GDM的發病機制尚不明確， 目前認為胰島素分泌缺陷和胰島素抵抗可能是GDM的重要發病機制。隨著孕婦體內血糖的增高， 過多的血糖可經由胎盤進入胎兒體內， 但是由于能夠產生降血糖作用的胰島素并不能通過胎盤血液屏障， 故而胎兒體內血液的血糖會較長時間處在過高情況， 這種情況會刺激胎兒自身胰腺激活， 分泌胰島素， 進而增強胎兒的新陳代謝以及蛋白、脂肪等的合成， 進而可能導致巨大兒出現[4]。由于胎兒自身分泌的胰島素能夠促進其生長發育， 故而一旦孕婦出現妊娠期糖尿病， 特別是在妊娠的中后期， 一旦胎兒胰島素的含量過高， 體內脂肪合成加速同時分解抑制， 相比于正常胎兒脂肪含量高出五成以上[5]。因此， 有效控制孕前體重， 孕期合理營養， 避免GDM發生以及對GDM孕婦進行膳食指導， 監測血糖， 是降低巨大兒發生的有效措施。

2. 2 營養因素 隨著近年對孕婦營養狀況的深入研究， 發現新生兒出生體重主要與孕婦的基礎營養和孕期營養攝入有關， 其中孕婦的基礎營養反映了孕前的營養狀況。研究顯示， 如果體內存在較之于常值過高的脂肪， 勢必會對機體帶來大量負面因素。相關學者[6]以1814例孕婦的孕前體質量指數（BMI）作為肥胖和正常體質量的篩選指標， 發現孕前肥胖組巨大兒的發生率為33.86%， 明顯高于正常體質量組的2.0%（P<0.05）。崔寶奎[7]對3231例病例進行研究， 發現孕婦在妊娠期間體重過重， 很容易導致新生兒體重過重， 甚至出現巨大兒現象， 同時對于母體而言， 也有可能導致孕婦的妊娠期糖尿病、高血壓等癥狀， 極其不利于妊娠安全。

2. 3 遺傳因素 胎兒在孕婦體內最初生長的階段其主要影響因素是遺傳因素， 這些遺傳因素通常通過對細胞和組織的生長的影響， 對胎兒初期生長發育起著至關重要的作用。遺傳因素在影響胚胎發育的過程中， 胎兒的基因型有著非常大的影響力。其中性染色體攜帶的遺傳因素可能會影響胎兒的體重， 有數據顯示正常男嬰通常比女嬰的體重略高200 g左右。在脂肪堆積的肥胖過程中， 接近80%左右是遺傳基因導致的?，F階段對肥胖的基因研究， 已經發現600余個與之相關的基因位點， 不同基因位點之間的協同作用進而影響機體的新陳代謝， 多基因共同影響產生肥胖[8]。宋春梅等[9]做家系調查發現巨大兒可能有家族遺傳傾向。

2. 4 產次 經產婦相比于未生產過的產婦而言， 其自身機體腹壁及子宮壁相對更加松弛， 且環境對妊娠的關注度不足， 營養供給失度， 身體重量進而大幅度上升， 與此同時也極有可能使得胎兒體重過高， 罹患巨大兒癥。相關數據顯示， 產婦隨著妊娠次數的提高， 不同產次胎兒的重量呈明顯上升態勢。劉月紅等[10]將382例經產婦與2099例初產婦比較， 經產婦的巨大兒檢出率（10.93%）高于初產婦（6.38%）， 差異具有統計學意義（P<0.05）。故而， 對產婦在妊娠期間的科學指導是防范巨大兒出現的有效措施。

2. 5 過期妊娠 過期妊娠即妊娠長于42周還沒有將胎兒分娩下， 如果過期妊娠胎盤形態功能基本正常者， 能維持胎兒在宮內繼續生長， 則發展為巨大兒。在同時存在糖尿病、肥胖和過期妊娠的婦女中， 巨大兒的發生率在5%～15%[5]。閆華[11]對大量足月和過期妊娠孕婦進行相關研究， 結果顯示過期妊娠中巨大兒出現病例高達6.04%， 相比于足月妊娠的0.68%而言， 顯然其存在更高的巨大兒危險隱患。

2. 6 妊娠期高血壓疾病 孕婦孕前和孕期體質量增長過多， 可使脂肪組織明顯增加， 導致孕婦及胎兒內分泌失調， 孕婦脂肪增加可引起體內活性雌激素水平升高， 通過醛固酮分泌， 經腎素-血管緊張素系統或通過增加腎小球重吸收， 引起鈉潴留， 導致妊娠高血壓疾病的發生。研究[12]發現高血壓疾病是巨大兒發生的獨立危險因素。另一方面， 妊娠期高血壓可能引發胎盤的灌流量減少， 進而誘發急性動脈粥樣硬化， 胎盤功能下降， 可致胎兒生長受限。

3 胎兒出生體重的產前預測

隨著超聲技術在產科的廣泛應用， 超聲檢查已經成為監測胎兒生長發育、預測胎兒出生體重的重要手段。目前臨床上預測胎兒體重方法多是采用統計學、多參數計算胎重。有學者指出在對妊娠后期的胎兒身體指標進行評價的過程中， 可以使用其腹圍進行評價， 如果該值高于36 cm， 那么此次妊娠過程的胎兒罹患巨大兒的可能性將急劇增高[13]。另有學者提出使用B超并不一定能夠起到非常精準的效果， 結合B超和腹圍對妊娠期孕婦進行檢查， 有利于對巨大兒身體指數進行科學有效快速的判斷[14]。清楚孕婦及胎兒的生理狀況， 對于孕婦順利生產而言具有至關重要的作用， 同時對于產婦產前、中、后期及新生兒健康狀況的預測提供更加可行的方案。