磷脂酶D及其產物磷脂酸的調控和功能研究進展

張軍林　郭曉紅　謝立蘭

摘要：磷脂酶D是廣泛存在于動植物各種組織和細胞中的一類磷酸二酯酶，自身及其代謝產物磷脂酸可以調控細胞內許多生理生化活動，例如細胞內囊泡運輸、細胞表面受體的信號傳導和細胞骨架蛋白重組等。本文主要討論哺乳動物磷脂酶D家族的分子生物學特點，及其代謝產物磷脂酸在磷脂酶D調控細胞生理和代謝性疾病上所發揮的重要作用。

關鍵詞：磷脂酶D；磷脂酸；細胞調控；囊泡融合

中圖分類號： Q556 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0015-04

磷脂酶D（phospholipase D，PLD）最先是在胡蘿卜提取物中發現的，具有磷酸二酯酶的活性，可以專一地水解卵磷脂產生脂質第二信使磷脂酸（phosphatidic acid，PA）和膽堿。PLD超家族成員廣泛存在于病毒、細菌、酵母菌、植物及動物體中。在哺乳動物細胞中，除白細胞和少數淋巴細胞外，均有PLD活性存在。20世紀90年代，研究人員克隆了PLD基因，發現PLD的活性及其代謝產物對動物的生理過程和某些疾病發生產生影響，如炎癥、糖尿病、細胞骨架重建、囊泡運輸和胞外分泌、腫瘤形成，以及嗜中性粒細胞氧化呼吸鏈的阻斷等。這些發現均來自于PLD的磷酸基團轉移作用，即在有水或一級醇（如乙醇、丁-1-醇）存在時，PLD能催化水解卵磷脂產生PA和磷脂酰乙醇或磷脂酰丁-1-醇。PA作為PLD在細胞中的主要代謝產物，在細胞內受到嚴格的調控。PA還可以被轉化成為另外2個具有生物活性的脂質分子，甘油二酯（diacylglycerol，DAG）和溶血磷脂酸（phosphatidicacid，LPA）。PA與這2個活性分子參與細胞中骨架蛋白重建、囊泡運輸和受體信號傳導等重要生理過程。本文主要討論哺乳動物PLD代謝的前體和產物，尤其是磷脂酸在PLD功能發揮中的作用。

1 磷脂酶D家族分子生物學特點

從植物、細菌和哺乳動物中克隆的磷脂酶D組成一個基因家族，具有一系列高度保守序列和特征，這個基因家族包括細菌PLD、磷酸轉移酶/磷脂合成酶、核酸內切酶和一些病毒外殼結構蛋白。目前對動物體中對PLD1、PLD2的研究較多，主要關注點是磷脂酰膽堿專一性磷脂酶D在糖尿病中性粒細胞和心臟、血管、腎臟、神經組織細胞中的酶活性改變，及其引起糖尿病各種并發癥改變的信號傳導途徑。PLD3、PLD4、PLD5基因是最近克隆出來的，它們具有與PLD1、PLD2相似的功能域（圖1），但其功能和表達調控的研究才剛剛開始?？傊?，PLD作為細胞信號傳導中重要的酶分子，參與了細胞功能的諸多方面，其具體的作用機制研究成為目前關注的熱點。

1.1 磷脂酶D家族的分子結構

所有克隆得到的真核生物PLD都具有一個相對保守的核心催化功能域（PLDc）、N-末端、C-末端區域。PLD催化核心域一般有Ⅰ～Ⅳ個域組成。在這4個短序列區域中，域Ⅰ和域Ⅱ、域Ⅲ、域Ⅳ具有特別相似的結構。保守域Ⅱ和Ⅲ之間插入的不同非保守片段也說明了這一點，并且這些插入片段或者Loop區對于人PLD1活性并非必需。除了域Ⅰ～Ⅳ域，在酵母、人和線蟲的序列中仍有其他的結構域，如核心催化功能域HKD基序，N末端的PX域（phox domain）和PH域（pleckstrin donmain）。PLD家族成員都具有一個保守序列（HXKX4DX6GG/S），它具有的催化活性使得PLD家族成員有相似的作用機理。HKD基序在PLD 家族中具有高度保守性。對PLD1、PLD2的研究表明，HKD基序中的組氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸殘基是催化作用所必需的。HKD 基序是PLD 的標志序列，具有催化水解的活性。這意味著真核生物PLD基因可能由同一基因經過復制和融合等基因重組過程進化而來。

有研究表明，PH域對于蛋白質的定位至關重要，序列缺失和定點突變會導致該蛋白不能在細胞內正確定位。PH域介導PLD1結合到脂質筏上，促進該酶的早期復性從而使其轉位到內涵體的質膜上[1]。刪除PH域并不影響PLD的酶活性，也不改變PLD催化反應對PI-4，5-P2依賴性，這導致了PI-4，5-P2結合基序的發現[2]。研究發現，PLD的PX域能夠介導蛋白質-蛋白質相互作用或者結合磷酸肌醇[3]。與其他磷酸肌醇單磷酸（如PI5P）明顯不同，PX域能夠優先與磷酸肌醇三磷酸結合[4]。相反，在脂質體結合分析中PX域卻與PI5P優先結合，由于PI5P是細胞內吞所需要的脂質體，這將有利于PLD1從質膜進入吞噬泡。與PLD2不同，PLD1具有保守的LOOP域，這一功能域具有負調控元件的作用，將該功能域缺失會導致PLD1的活性下降3倍。對PLD3、PLD4、PLD5進行蛋白質功能域預測分析，發現它們都沒有PH和PX功能域，但卻均在2個催化活性域之間多出1個envelope功能域。envelope功能域一般存在于病毒包膜蛋白中，而結合在質膜上的PLD通常通過把磷脂轉化成磷脂酸來改變細胞膜的脂質結構，從而調節細胞內的脂質運動，這預示著這3個磷脂酶D很有可能具有不同于PLD1、PLD2的功能。

1.2 磷脂酶D的細胞定位

PLD1和PLD2在細胞中的定位是不同的。通過研究不同細胞系發現，PLD1主要分布于核周際，如高爾基體、內質網或后期囊泡[5]。也有觀點相反的報道認為，PLD1只分布于后期囊泡和溶酶體中，高爾基體中就沒有PLD1的分布[6]，而在未被刺激的細胞中，PLD1只分布于質膜[7]。但是現在研究發現，受到外界刺激后PLD1會轉移到質膜[8]。實際上，由于細胞系囊泡循環的頻率和數量不同以及PLD1調控的定位，只能以細胞內PLD1動態循環的概念來解釋。

PLD2主要分布于質膜[9]，同時在胞質、囊泡體[10]和β肌動蛋白[11]中也有分布。在血清和表皮生長因子（EGF）刺激下PLD2會轉移到細胞膜褶皺上。

2 PLD代謝產物PA的功能

PLD水解產生的PA參與多方面的細胞代謝功能。PA既可以在細胞信號轉導中起作用，如參與磷酸肌醇激酶的激活或作為蛋白質的脂類結合伴侶募集蛋白質等過程。PA也可以通過前面所述途徑被轉化成具有生物活性的脂質分子DAG和LAP，參與細胞內信號傳導的調節。同時，PA在囊泡運輸，內吞作用和分泌過程中都發揮著重要作用?？傊?，PA在以上這些過程中的功能通常是作為第二信使、脂類船塢和增融性脂質功能的聯合，以下將分別討論。

2.1 PA作為第二信使的作用

PA參與細胞內信號傳導，包括激活PI4P 5-激酶，激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），以及與Raf激酶結合等許多通路。PA的1個重要下游靶標是Ⅰ型PI4P 5-激酶，它可以催化PI4P產生PI-4，5-P2。與其他脂類分子相比，只有PA可以在體外激活牛腦中提取的PI4P 5-激酶。后來研究表明，PA只能激活Ⅰ型而非Ⅱ型PI4P 5-激酶。Ⅰ型PI4P 5-激酶第3個變體的克隆和研究也證實了這一說法，并且這一過程與體內肌動蛋白聚合調控相關[12]。EGF介導PLD2的活化和轉位導致質膜褶皺中PA的大量積累，從而激活質膜上PI4P 5-激酶來促進褶皺的產生。不但PLD產生的PA可以激活Ⅰ型PI4P 5-激酶α，而且PA的轉化產物LPA處理豬動脈血管內皮細胞也能激活Ⅰ型PI4P 5-激酶α[13]。另外，PA雙?；湹慕M成也是也是PA研究的一個方面。雙?；淧A（8 ∶ 0）對PI4P 5-激酶具有相似的激活效率[14]。有研究表明，蛋黃提取物具有混合?；湹腜A，也能激活PI4P 5-激酶。因此，PA作為細胞內重要的信號傳遞分子，與其來源和?；湹慕M成無關。

PLD與細胞抗凋亡的多種生存信號通路有關。作為細胞周期和增殖效應器的mTOR就是PLD抗凋亡的下游激活因子。在血清刺激下HEK293細胞內PA瞬時增加，從而導致mTOR及其下游蛋白S6激酶Ⅰ（S6K Ⅰ）的激活。體外研究發現，PA可以與mTOR在12-雷帕霉素結合域FK506直接作用[15]，與脂類分子（PC、PS、PE、PI和PIPs）相比，PA具有專一性。用mTOR抑制劑雷帕霉素處理細胞能夠阻滯PA與mTOR作用，說明PA與雷帕霉素是競爭性結合的。超表達PLD2能夠阻滯雷帕霉素，從而抑制細胞增殖，進一步說明PLD與mTOR調控有關[16]。脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）可以刺激胞內PA增加，這一過程對mTOR激活介導的細胞因子的釋放具有重要作用。佛波脂能加強細胞因子的釋放，而丁-1-醇卻阻滯這一過程，也說明PLD2參與其中。然而，有研究表明PLD1是mTOR信號的效應酶，并且也是Cdc42的下游分子。在血清刺激下，超表達衍生型PLD1能加強S6KⅠ的活性，而無活性PLD1的表達相對與對照組會減低S6KⅠ的活性。另外，干擾RNA（siRNA）干擾2種細胞系中PLD1能夠基本完全抑制血清刺激下S6K Ⅰ的激活[17]。最近有研究發現，PLD1確實是mTOR激活的必需酶[18]。綜上，mTOR是PLD1產生PA的確定靶標，并且這一途徑與磷酸肌醇3激酶生存通路同時存在。

2.2 PA是脂類合成前體

PA能經磷脂酸磷酸水解酶（phosphatidic acid phosphohydrolase，PAP）轉化生成脂質第二信使DAG。PAP的變體PAP2b經常出現在PLD2富集的膜區域，很有可能促進PLD生成的PA快速轉化成DAG。DAG能夠激活經典型和大多數PKC家族成員。PAP轉化PA生成DAG的種類由PA二酰鏈的飽和度決定。值得注意的是，隨著DAG的飽和度增高，便不能在體內激活PKC。因此，雖然這些高飽和度的DAG的作用還不清楚，但是它至少是消弱PLD生成PA信號的一種有效途徑。PA也可以通過磷脂酶A轉化成單?；腖PA。LPA是一種有效的有絲分裂原，在細胞增殖、遷移和生存等過程中具有重要作用。但是有關PLD產生的PA轉化的LPA和DAG的具體作用還有待研究。

2.3 PA在囊泡運輸、吞噬作用和胞外分泌中的功能

PLD及其產物PA與細胞內囊泡運輸、吞噬作用和胞外分泌等功能密切相關。PLD可以通過激活ARF促進高爾基體分泌泡形成。用一級醇（如乙醇）可以阻滯蛋白質從內質網到高爾基體的運輸，但外加含有PA的脂質體能減弱這一過程。PA對蛋白質的募集依賴于高爾基體反式面分泌泡的形成。但是PLD在囊泡形成中的作用仍不清楚，PLD在高爾基體上的定位也有待于進一步研究。

相反，PLD在分泌泡形成和胞外分泌中的作用卻比較清楚，這一過程主要依賴于ARF的激活。這些過程都曾在神經內分泌細胞、脂肪細胞、胰腺β細胞和肥大細胞做過研究[8，19]。在神經內分泌細胞中，ARF6專一性的通過PLD1依賴的PI-4，5-P2途徑啟動胞外分泌。最新研究表明，神經內分泌細胞的過程是通過PLD1的PH域調控，并且PLD也與人支氣管內皮細胞中鞘氨醇1-磷酸誘導的白介素-8分泌有關[9]。

PLD2是細胞內吞作用中受體信號向胞內傳導的重要媒介。表皮生長因子受體信號的傳導能被丁-1-醇阻滯，并且EGF與受體結合后會促使胞內PA含量的增高，這都說明PLD參與其中。PLD1和PLD2的超表達均能引起受體信號的加強，而它們失活型的超表達均引起受體胞內信號的減弱[20]。μ-opioid受體MOR1與PLD2也有一定的功能性聯系。研究發現，能加強胞吞作用的受體會激活PLD2，而其他受體均不能激活PLD2。另外，受體信號的向內傳導是ARF依賴性的[21]。由于MOR1信號的向胞內傳導會被丁-1-醇或失活型PLD2的超表達阻滯，因此PLD2在受體信號向胞傳導中具有一定作用[21]。丁-1-醇和siRNA干擾PLD2均能阻滯谷氨酸受體介導的胞吞作用[22]。失活型PLD2的超表達和用siRNA干擾PLD2也均能阻滯血管緊張素Ⅱ受體信號引起的胞吞作用[9]?？傊?，受體的胞吞是PLD2在細胞內功能的重要體現。

PLD催化水解PC生成的PA具有促進細胞內囊泡運輸等很多功能（圖2）。PA能夠作為脂質船塢募集蛋白，激活PI4P5-激酶生成PI-4，5-P2，具有增進質膜上脂質融合的作用。生成的PI-4，5-P2通過募集CAPS促進密集的囊泡進行胞外分泌[23]。由于PLD將非增溶性脂質PC轉化成增溶性脂質PA，PLD在脂質融合中的功能倍受重視。PA的頭部基團和脂質?；溳^小，也可以最大限度地降低內膜曲面形成負曲率的活化能[24]。PA同樣可以更進一步形成另外2種增溶性脂類DAG和LPA[25]。LPA能夠通過PI3K/PKCzeta通路激活PLD的活性[26]，也能促進PA所在膜反面曲率的形成[27]。LPAAT酶、endophilin又可以將PLA轉化生成PA從而促進細胞內吞[28]。也有研究發現，添加PA能提高囊泡的融合率[29]。抑制PLD1的活性會減少質膜外圍小葉上葡萄糖轉運酶的數量，卻不能阻滯囊泡向質膜的運輸，這說明PA的生成缺乏會導致膜融合受阻[8]。綜上所述，PLD生成的PA及其進一步的代謝產物（如PLA）在質膜融合和膜上囊泡形成中具有重要作用。

3 結論與展望

隨著對PLD1、PLD2的深入研究，以及最近對PLD3、PLD4、PLD5的克隆，哺乳動物PLD的研究取得了重要進展。確定PLD1、PLD2許多功能性基序和蛋白域，對加深了解PLD調控規律和體內功能具有重要意義。PLD涉及到的細胞內反應與許多生理和病理過程相關，如在糖尿病及其并發癥中許多組織也有PLD功能紊亂的跡象；PLD在神經退行性疾病中減輕神經細胞的凋亡、誘導神經細胞分化填補損傷區域及促進神經遞質釋放方面都起到一定的作用；PLD通過血管緊張素Ⅱ、去甲腎上腺素、氧化型低密度脂蛋白和多巴胺受體D5等分子參與高血壓的發生；PDL也參與Ⅰ型和Ⅱ型肌纖維中由胰島素或肌肉收縮引起的肌細胞葡萄糖跨膜轉運的信號轉導系統；在許多腫瘤組織中，PLD 的活性異常升高，大量的研究表明PLD與腫瘤的關系密切。因此，PLD已被廣泛認為是目前藥物分子設計的重要靶標，加快對它相關功能和特征的研究就有重要意義。

PLD參與的信號通路主要是與PA相互作用的靶標蛋白質及其功能有關，因此與PA直接作用的蛋白質的研究成為目前研究的熱點，它們之間相互作用至少有2個功能，即調控酶的活性、募集特定膜蛋白。理論模型研究表明，PA在PLD功能發揮如質膜融合中具有一定的作用。PA敏感蛋白TAPAS1、酵母Opilp的發現有助于更好地確定細胞內PA水平的變化及其與PLD和靶標的協調作用[30]。用質譜分析等先進的脂質檢測方法可以分辨出一定刺激下細胞內PA分子種類的變化，確定出PA是來源于二酰甘油激酶作用多不飽和PA還是PLD酶解單不飽和PC或飽和PC。隨著質譜分析靈敏度的提高，就可以通過分離亞細胞結構進一步分析PA的分子種類和分布，對PA的深層次研究有助于對PLD更加全面地了解。

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