結核分枝桿菌Erp蛋白PGLTS的4基序突變體的構建

郝秀靜　馬超　李敏

摘要：以結核分枝桿菌H37Ra DNA為模板，通過PCR擴增，獲得靶基因erp片段。采用重疊延伸PCR的方法得到erp基因PGLTS的4基序的突變體，依次刪除突變體的C-末端、N-末端和C/N-端，構建重組質粒pET28a-C4、pET28a-N4、pET28a-CN4，轉化BL21（DE3）pLysS。對重組菌株IPTG誘導后的表達產物進行Tricine SDS-PAGE，得到大小分別約為11.2、15.4、4.8 ku的目的蛋白。Western blotting分析結果表明，目的蛋白表達特異。

關鍵詞：結核分枝桿菌；重復輸出蛋白；重疊延伸PCR；PGLTS；原核表達

中圖分類號：S855.2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0031-03

牛結核病是影響養牛業最為嚴重的疫病之一，且該病為人畜共患傳染病，既造成了極大的經濟損失還嚴重威脅著人類健康，其主要致病菌為牛結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）[1]。重復輸出蛋白（exported repeated protein，ERP）是牛結核分枝桿菌上的一個重要毒力因子[2]，別稱P36、Pirg或Rv3810，它是一種分泌蛋白，存在于結核分枝桿菌復合體所有成員（結核分枝桿菌、牛型結核分枝桿菌、非洲分枝桿菌、卡介苗和田鼠分枝桿菌）中[3]，而在其他細菌種內沒有發現同族體，使得Erp成為結核分枝桿菌家族的一個特異信號分子。ERP蛋白全長為284個氨基酸，由3個不同區域組成，其中1～22個氨基酸是信號肽序列，中心是基于PGLTS基序的12個重復區[4]，N-末端結構域（氨基酸1～80）和C-末端結構域（氨基酸176～284）高度保守。N-末端含有運送Erp通過質膜的信號肽序列，由22個氨基酸組成，帶正電荷的堿性氨基酸（尤其是精氨酸和賴氨酸）含量較為豐富，對于蛋白質定位和導肽序列識別有一定作用[5-6]。C-末端富含疏水性氨基酸，可能與膜骨架網絡和細胞質膜之間的連接有關，Kocincova等證實Erp蛋白疏水性 C-末端的作用——將Erp錨定在細菌表面[7]。中間是PGLTS重復區，它的重復區具有一定的可變性，如麻風分枝桿菌的PGLTS 重復區是4基序、牛結核分枝桿菌是12基序、而恥垢分枝桿菌是21基序[5]。為研究 Erp 的 PGLTS 區基序變化以及C-端、N-端與功能的關系，本研究通過查詢GeneBank中erp基因序列，以結核分枝桿菌H37Ra DNA為模板，通過PCR擴增，獲得靶基因erp片段。采用重疊延伸PCR的策略，得到含4基序的PGLTS突變體及基序 C-端、N-端和 C/N-端缺失突變體并構建到原核表達載體中，經IPTG誘導表達，為以后進一步深入研究其基序變化以及C端、N端功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

結核分枝桿菌H37Ra、大腸桿菌DH（5α）和質粒pET28a（+）由西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室保存，MD18-T Vector、BL21（DE3）pLysSp購自Transgene公司。

1.2 試劑與儀器

限制性核酸內切酶HindⅢ、KpnⅠ、XhoⅠ，T4 DNA連接酶和Wizard PCR preps DNA Purification System為Promerga公司產品；Taq PCR MasterMix試劑盒、Pfu PCR MasterMix試劑盒、HRP-DAB底物顯色試劑盒、D2000等DNA marker、100 ku 等預染蛋白質marker為天根生化科技（北京）有限公司產品；IPTG、X-Gal、氯霉素、氨芐青霉素購自Sigma公司；胰化蛋白胨（tryptone）、酵母提取物（yeast extract）為OXOID產品；氨基乙酸（甘氨酸）、瓊脂粉等化學試劑為索萊寶公司產品。

1.3 引物設計

利用Primer Premier 5.0設計的引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，主要包括：

其中，小寫字母表示保護性堿基，下劃線表示酶切位點，長引物PN1表示在5′端加上Erp信號肽序列。

1.4 野生型erp序列擴增

以結核分枝桿菌H37Ra基因組DNA為模板，引物EP1、EP2擴增erp。50.0 μL反應體系包括20 ng/μL DNA 1.0 μL、10 mol/L上游引物2.0 μL、10 mol/L下游引物 2.0 μL、2×Taq PCR MasterMix 25.0 μL、ddH2O 20.0 μL。反應條件為：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性1 min，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，擴增30個循環；72 ℃延伸 7 min。反應產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 ERP 4基序突變體的構建

1.5.1 ERP 6基序突變體的構建 利用重疊延伸技術，以EP1、EP3和EP2、EP4為引物，以重組質粒pMD18-T-E為模板，依次經過第1、第2輪PCR擴增得到erp 6個基序的突變體片段，連接到pMD18-T載體上，命名為pMD18-T-6。

1.5.2 ERP 4基序全長突變體的構建 利用重疊延伸技術，以EP1、EP5和EP2、EP6為引物，以重組質粒pMD18-T-6為模板，依次經過第1輪、第2輪PCR擴增得到erp 4基序的序列片段。

1.6 4 基序缺失突變體的表達載體構建 以EP7、PN1、PN2、PC、EP8為引物，以pMD18-T-4為模板，擴增erp 4基序 C-端、N-端和C/N-端缺失基因片段。缺失基因擴增產物和表達載體pET28a（+）連接，構建4基序為PGLTS突變體C-端、N-端和C/N-端缺失的原核表達載體，并命名為pET28a-C4、pET28a-N4、pET28a-CN4。

1.7 核苷酸序列測定

利用ABI PRISM 3730 核苷酸序列分析儀，對質粒pET28a-C4、pET28a-N4、pET28a-CN4進行核苷酸序列測定，以獲得erp（4基序）的突變序列，具體工作由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.8 IPTG誘導表達重組蛋白并檢測

接種環劃線BL21（DE3）plsys（pET28a-C4、pET28a-N4、pET28a-CN4），過夜培養12 h，挑取單個菌落，接種于含30 μg/mL Kan的LB培養基中，于37 ℃、180 r/min下培養 12～16 h。將該菌液以1%接種量接種于含30 μg/mL Kan LB培養基的三角瓶中，于37 ℃、180 r/min下搖瓶3 h，加入 IPTG 使終濃度達到1 mmol/L，于32 ℃、180 r/min下過夜誘導表達，進行SDS-PAGE檢測。

1.9 重組表達產物的SDS-PAGE及Western blotting分析

將挑取的陽性菌落進行培養，加入IPTG，于32 ℃下過夜誘導表達，收集菌體，提取蛋白后進行SDS-PAGE檢測及Western blotting分析，檢測時陽性血清為1 ∶ 200 倍稀釋的兔陽性血清，二抗為1 ∶ 800 倍稀釋的HRP標記的兔抗鼠IgG。

2 結果與分析

2.1 野生型erp序列擴增

利用PCR技術從結核分枝桿菌H37Ra基因組DNA中擴增出大小約為855 bp的基因片段（圖1），連接到pMD18-T載體中。

2.2 ERP 4基序突變體的構建

2.2.1 ERP 6基序突變體的構建 利用重疊延伸技術，以EP1、EP3和EP2、EP4為引物，以重組質粒pMD18-T-E為模板，依次經過第1輪（圖2）、第2輪（圖3）PCR擴增得到erp 6個基序的突變體片段，連接到pMD18-T載體中。將含有目的基因的重組質粒分別進行酶切鑒定和序列測定，與預期結果一致，將重組質粒命名為pMD18-T-6。

2.2.2 ERP 4基序全長突變體的構建 利用重疊延伸技術，以EP1、EP5和EP2、EP6為引物，以重組質粒pMD18-T-6為模板，依次經過第1輪（圖4）、第2輪（圖5）PCR擴增得到erp 4基序的序列片段。

2.3 4基序缺失突變體及其表達載體的構建

利用PCR技術，以EP9、PN1、PN2、PC、EP10為引物，以pMD18-T-4為模板，擴增erp 4基序 C-端、N-端和C/N-端缺失基因片段，分別為405、495、231 bp的產物（圖6）。

缺失基因擴增產物和表達載體pET28a（+）經過HindⅢ和XhoⅠ雙酶切，經Wizard PCR preps DNA Purification System試劑盒純化回收后用T4 DNA Lingase進行連接，4 ℃過夜，連接產物轉化至BL21（DE3）pLysS 中，提取質粒進行酶切鑒定（圖7），將篩選得到的陽性重組子分別命名為pET28a-C4、

pET28a-N4、pET28a-CN4。對其進行核苷酸序列測定，結果表明其基因序列和閱讀框架正確。

2.4 IPTG誘導表達重組蛋白及SDS-PAGE分析

將用于毒性蛋白表達的BL21（DE3）pLysS菌株作為pET28a-C4、pET28a-N4、pET28a-CN4融合基因的表達宿主菌，經轉化挑取單個菌落培養，IPTG過夜誘導，菌體處理后，用Tricine SDS-PAGE分析，結果表明菌體中含有目的蛋白（圖8），分子量大小分別約為11.2、15.4、4.8 ku，與理論值相符，表明融合基因可在BL21（DE3）pLysS中實現表達。

2.5 表達產物的 Western blotting分析

BL21（DE3）pLysS（pET28a-C4）、BL21（DE3）pLysS（pET28a-N4）和BL21（DE3）pLysS（pET28a-CN4）表達產物進行Western blotting試驗分析，結果表明，重組蛋白可以被His-Tag特異性抗體識別，在約11.2、15.4、4.8 ku處出現識別條帶，而陰性對照在相同的位置沒有條帶（圖9），表明毒性蛋白在宿主菌中特異表達。

3 結論與討論

結核病是由結核分枝桿菌引起的一種人畜共患病，它嚴重威脅人類健康，大約每年導致180萬人死亡[8] 。erp基因是結核分枝桿菌中一個重要的毒力基因，Christine等研究發現Erp 蛋白在分枝桿菌的細菌壁滲透性屏障形成中起重要作用，Erp缺陷可造成細菌壁通透性的缺陷，使之可以透過一些親脂性物質，致使細菌對宿主的防御反應敏感，如活性氧、活性氮和防御素等可以透過細菌壁而對細菌起到殺傷作用[9]。Erp不僅僅是一種毒力因子，在麻風結核桿菌中還是一種免疫優勢抗原，可以誘發機體的細胞免疫和體液免疫。早期研究空洞和非空洞結核病患者時發現，Erp蛋白僅可以刺激空洞性結核病患者機體產生抗體，而在結核病潛伏感染者體內很少甚至沒有抗體產生[10]。

Kyte-Doolittle分析Erp蛋白時顯示，C-末端富含疏水性氨基酸可能與膜骨架網絡和細胞質膜之間的連接有關。Kocincova等對恥垢結核分枝桿菌Erp進行突變，闡釋該蛋白疏水性C-末端將Erp錨定在細菌表面。ERP蛋白的N-端，PGLTS 重復區序列的不同對該蛋白質的致病性和輸出運輸具有較大的影響，但是目前在ERP基序變化以及C、N端功能方面的研究還不是很清楚。

本試驗成功克隆了結核分枝桿菌erp，對erp進行一系列突變，得到4個基序的突變體，以pET28a（+）為載體構建大腸桿菌融合表達系統——BL21（DE3）pLysS（pET28a-C4）、BL21（DE3）pLysS（pET28a-N4）和BL21（DE3）pLysS（pET28a-CN4），經Tricine SDS-PAGE檢測，目的蛋白大小為11.2、15.4、4.8 ku。Western blotting結果顯示，目的蛋白能被特異性抗體識別，本研究結果為進一步研究Erp的功能奠定了基礎。

參考文獻：

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