2011-2013年無錫地區人腺病毒流行特征與分型

馬廣源 劉瑞霞 肖勇 鮑靜 季亞勇 吳家林 凌霞

214023 無錫市疾病預防控制中心(馬廣源、肖勇、鮑靜、季亞勇、吳家林、凌霞)；250031 濟南市技師學院(劉瑞霞)

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·論著·

2011-2013年無錫地區人腺病毒流行特征與分型

馬廣源 劉瑞霞 肖勇 鮑靜 季亞勇 吳家林 凌霞

214023 無錫市疾病預防控制中心(馬廣源、肖勇、鮑靜、季亞勇、吳家林、凌霞)；250031 濟南市技師學院(劉瑞霞)

馬廣源、劉瑞霞為共同第一作者

目的 了解2011-2013年無錫地區人腺病毒的流行的基因型及規律。 方法 對2011-2013年無錫市人民醫院送檢的1 893份急性呼吸道感染標本，用Real-time PCR方法擴增腺病毒基因，檢出的陽性標本接種Hep-2細胞分離病毒，然后對其擴增產物進行純化和測序比對，所得基因序列用Bioedit和MEGA 5.0進行進化樹分析。結果 2011-2013年無錫地區人腺病毒全年都有出現，多發生在冬春季，1-3歲的兒童檢出率(44.26%)最高，型別主要有B亞群的HAdV-3型4株(13.33%)、HAdV-7型6株(20.00%)和C亞群HAdV-1型5株(16.66%)、HAdV-2型8株(26.67%)、HAdV-5型3株(10.00%)、HAdV-6型4株(13.33%)?；蜻M化樹形成2個獨立的分支，C亞群逐漸成為優勢株。結論 2011-2013年無錫地區人腺病毒有明顯的季節性，多發生在冬春季，1-3歲的兒童是主要的易感人群。B和C兩種亞群6個血清型為優勢流行株，推測有B亞群向C亞群轉變的流行趨勢。

FondPrograms:ScienceandTechnologyProjectofWuxiScience&TechnologyBureau(CSE31N1430)

急性呼吸道感染(Acuterespiratorytractinfec-tion，ARTI)是全球范圍內人類最常見的傳染性疾病之一[1]，發病率居急性傳染病的首位。ARTI也是威脅兒童健康的主要因素，造成每年大約200萬兒童死亡，已成為5歲以下兒童死亡的第二大病因[2]。人腺病毒(Hadv)是引起全球5-10%幼兒和兒童急性呼吸道感染的主要原因，即使在發達國家，低于5歲的兒童急性呼吸道感染較高的死亡率和發病率也造成了一定的社會負擔[3]。到目前為止，人腺病毒已發現有60多種血清型[4,5]，A-G7種亞屬,型別C1、C2、C5、C6、B3、B7、B11和E4是導致人主要急性呼吸道感染的主要原因。為了解和掌握在無錫地區流行的腺病毒的基因型和特征，對2011-2013年流行的腺病毒進行病毒分離、病毒基因測序以及種屬分布及基因特征分析，為預防和控制腺病毒引起的相關傳染病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 毒株來源 從無錫市人民醫院(兒童醫院)采集發病3d以內的急性呼吸道感染病例(發熱、白細胞分布異常，咽部不適、鼻塞、流涕、咳嗽等臨床表現者，缺乏其他實驗室確定診斷依據)的鼻咽拭子或含漱液標本，在4 ℃保存條件下于24h內送至實驗室。

1.2 病毒核酸提取及Real-timePCR檢測 用羅氏公司的RocheMagNAPureLC2.0 全自動核酸提取儀提取總核酸(DNA/RNA)，提取物用100μl洗脫液溶解，立即置-70 ℃冰箱保存備用。應用北京金豪科技有限公司的熒光定量RT-PCR核酸檢測試劑盒檢測腺病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒。

圖1 2011-2013年無錫地區人腺病毒流行Fig.1 Prevalence of human adenoviruses in Wuxi area from 2011 to 2013

1.3 Hep-2細胞培養 選擇熒光PCR檢測結果為腺病毒陽性的標本，0.22 μm濾膜過濾，接種長成單層的Hep-2細胞，常規培養，每日觀察細胞病變。

1.4 Hexon基因擴增及序列測定 合成腺病毒Hexon基因測序引物，用TaKaRa公司的EX Taq 試劑盒(Drr001r)進行擴增，由上海美吉生物醫藥科技有限公司測定序列。

1.5 基因比對和種系發生樹構建 使用Bioedit 進行序列的比對和分析, MEGA version 4.0 軟件繪制基因種系發生樹，進化樹構建采用鄰位相臨法(Neighbor-Jointing, N-J)。

2 結果

2.1 2011-2013年無錫地區人腺病毒流行情況 2011-2013年共檢測到人腺病毒61株，這期間甲型流感病毒和乙型流感病毒共同流行。人腺病毒占同期所有標本的3.22%(61/1 893)，而甲型流感病毒占同期所有標本的6.55%(124/1 893)，乙型流感病毒占同期所有標本的3.75%(71/1 893)。從圖1看出人腺病毒在全年都有出現，多發生在冬春季，夏季僅在2011年的6月份出現4株，2013年的6、7月各出現1株，其余均未檢測到。

2.2 人腺病毒感染人群分布和臨床特征 61份檢出陽性標本的感染人群都為兒童，最小2個月，最大8歲。感染患兒各年齡段都有分布，小于1歲的患兒有11例，占18.03%；1-3歲的兒童發病率最高有27例，占44.26%；3-6歲的兒童有15例，占24.59%；大于6歲的兒童有8例，占13.11%。男、女性別比例為29∶32。61份感染人群中有發熱癥狀的45例，占73.77%；有咳嗽癥狀的36例，占59.02%；有咽炎癥狀的30例，占49.18%；有肌肉酸痛癥狀的30例，占49.18%；有肺炎癥狀的26例，占42.62%。

圖2 2011-2013年無錫地區人腺病毒hexon基因進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of HAdV hexon gene in Wuxi area during 2011-2013

2.3 2011-2013年無錫市人腺病毒分子分型特征 61份核酸陽性標本進行病毒分離，有30份出現明顯的細胞病變，病毒分離率為49.18%。對這30份標本進行病毒基因PCR擴增、測序并鑒定其型別。30株分離株序列及GenBank中19株人腺病毒代表株序列進行種系進化樹分析，結果顯示2011-2013年30株人腺病毒分離株分屬2個進化分支，屬于2個亞群(亞群B、C)中的6種型別。C亞群占66.67(20/30)，B亞群占33.33%(10/30)。三年中都出現B亞群和C亞群，2011年B亞群居多有5株、而C亞群只有2株；2012年B亞群有3株、C亞群有8株；2013年B亞群有2株、C亞群有10株。B亞群中HAdV-3型2012年未檢出，而C亞群中HAdV-6型2011年沒有出現，HAdv-5型僅在2013年出現。由此可看出無錫地區腺病毒流行趨勢由B亞群向C亞群轉變。

2.4 各型別腺病毒hexon基因核苷酸序列親緣性關系及氨基酸同源性分析 利用 Bioedit 和 MEGA5.0 軟件對HAdV-3、7、1、2、5、6序列及 Genbank中相應型別hexon基因全長序列參考株進行親緣性關系分析，其中Hadv-3參考株1株、HAdV-7參考株1株、HAdV-1參考株1株、HAdV-2參考株3株、HAdV-5參考株1株、HAdV-6參考株1株。從圖2清晰的看到，2011-2013年無錫市20株人腺病毒Hexon基因分處進化樹的B、C亞群，分支獨立，彼此間親緣關系清晰。各HAdV型別與其對應的參考株同源性較高，同源性在96.13%-100%之間，最高同源性為HAdV-7型，最低同源性為HAdV-6型。

3 討論

腺病毒是引起人急性呼吸道感染的重要病毒病原之一，在不同國家、地區流行的腺病毒都會有所不同[6]，有些型別可能在一個國家多個地區之間交替流行[7]。北方地區如北京2003-2012年監測結果顯示呈全年散發，沒有明顯的季節差異，1-3歲為易感人群[8]。南方地區如蘇州2005-2007年腺病毒住院感染病例呈春、夏季明顯高于秋、冬季，1-2歲檢出最多[9]。無錫地區2011-2013年監測結果顯示Hadv呈現明顯的季節性，主要以冬春季為主，夏季檢出很少；1-3歲的兒童發病率最高，占44.26%；大部分患兒伴有發熱、咳嗽等癥狀。

本研究報道了2011-2013 年間無錫地區兒童感染呼吸道腺病毒的流行狀況及分型結果，顯示近三年引起呼吸道腺病毒感染的型別主要為B、C亞群，而B亞群主要為3型和7型，這與中國其它地區關于HAdV的檢測結果相似，也與亞洲地區[10]主要以HAdV-3、7在兒童呼吸道感染中占主要地位結果一致。但是在本次研究中C亞群成為主導毒株，與其他研究結果[11,12]B亞群為主導不同。從進化結果來看有B亞群向C亞群轉變的流行趨勢，且在2013年C亞群檢出Hadv-5型。從親緣進化樹和氨基酸同源性分析的結果來看，本研究中腺病毒各型別序列與相應參考株的氨基酸的同源性均較高，且均未發現明顯的變異，Hadv-7型同源性非常之高。腺病毒是DNA病毒，它們的進化速度相對較慢。

腺病毒引起的兒童感染近幾年趨勢有明顯的回升，且癥狀比較重，個別地方會出現散在性暴發疫情。因此，我們應該加強對腺病毒分子流行病學的連續監測，開展流行病學調查、疫苗研發就顯得尤為重要。

[1] Tang LY, Wang L, Tan XJ, et al. Adenovirus serotype 7 associated with a severe lower respiratory tract disease outbreak in infants in Shaanxi Province, China[J]. Virol J, 2011, 8:23. doi: 10.1186/1743-422X-8-23.

[2] Williams BG, GouwsE, Boschi-Pinto C, et al. Estimates of world-wide distribution of child deaths from acute respiratory infections[J]. Lancet Infect Dis, 2002,2(1):25-32.doi:10.1016/S1473-3099(01)00170-0.

[3] Ma, GY, Zhu, YZ, Xiao Y, et al. Species C is Predominant in Chinese Children with Acute Respiratory Adenovirus Infection[J]. Pediatr Infect Dis J,2015,34(9):1042. doi: 10.1097/INF.0000000000000791.

[4] Matsushima Y, Shimizu H, Kano A, et al. Novel human adenovirus strain, Bangladesh[J]. Emerg Infect Dis,2012,18(5):846-848.doi: 10.3201/eid1805.111584.

[5] 唐瀏英, 劉秀云, 蘆起,等. 2004年冬至2005 年春引起北京地區兒童肺炎的腺病毒基因特點分析[J],病毒學報,2006,22(4):286-291. doi :10.13242/j.cnki.bingduxuebao.001734.

[6] Chang SY, Lee CN, Lin PH, et al. A community-derived outbreak of adenovirus type 3 in children in Taiwan between 2004 and 2005[J]. J Med Virol, 2008, 80 (1):102-112.doi: 10.1002/jmv.21045.

[7] Kajon AE, Lu X,Erdman DD, et al. Molecular epidemiology and brief history of emerging adenovirus 14-associated respiratory disease in the United States[J]. J Infect Dis, 2010,202(1):93-103.doi: 10.1086/653083.

[8] 鄧潔, 錢淵, 趙林清,等.2003-2012年北京兒童急性呼吸道感染中腺病毒監測及流行型別分析[J]. 病毒學報,2013,6(29):615-619.doi:10.13242/j.cnki.bingduxuebao.002427.

[9] 范麗萍, 張學蘭, 孫惠泉,等.蘇州地區呼吸道感染住院患兒腺病毒檢測分析[J].臨床兒科雜志,2008,10(26):866-868.doi:10.3969/j.issn.1000-3606.2008.10.013.

[10] Moura PO, Roberto AF, Hein N, et al. Molecular epidemiology of human adenovirus isolated from children hospitalized with acute respiratory infection in S?o Paulo[J]. Brazil J Med Virol, 2007,79(2):174-181.doi: 10.1002/jmv.20778.

[11] Langenfeld E, Deen M, Zachariah E, et al. Small molecule antagonist of the bone morphogenetic protein type I receptors suppresses growth and expression of Id1 and Id3 in lung cancer cells expressing Oct4 or nestin[J]. Mol Cancer,2013,12(1):129.doi: 10.1186/1476-4598-12-129.

[12] Li XR, Bian Y, Takizawa Y, et al. ERK-Dependent Down regulation of Skp2 Reduces Myc Activity with HGF，Leading to Inhibition of Cell Proliferation through a Decrease in Id1 Expression[J]．Mol Cancer Res,2013,11(11):1437-1447.doi: 10.1158/1541-7786.MCR-12-0718.

Epidemiological characteristic and typing of human adenovirus in Wuxi area of 2011-2013

MaGuangyuan，LiuRuixia,XiaoYong，BaoJing，JiYayong，WuJialin，LingXia

WuxiCenterforDiseaseControlandPrevention,Wuxi214023,China(MaGY,XiaoY,BaoJ,JiYY,WuJL,LingX);Ji′nanTechnicanColloge,Ji′nan250031,China(LiRX)

MaGuangyuanandLiuRuixiaarethdfirstauthorswhocontributedequallytothearticle

LingXia，Email：mgy2004165@163.com

ObjectiveTostudytheepidemiologicalcharacteristicsandtypeofhumanadenovirus(HAdv)inWuxiareain2011-2013.MethodsAtotalof1983acuterespiratoryinfectionssampleswerecollectedfromWuxiPeople′sHospitalduring2011-2013.HAdvwasdetectedbyReal-timePCR,thepositivesampleswereinoculatedintoHep-2cellstoisolatetheviruses.Theamplificonswerepurifiedandsequenced,andthesequenceswereanalyzedbyBioeditandMEGA5.0.ResultsHumanadenoviruswasappearedthroughouttheyearinWuxiareaduring2011-2013.Inwinterandspring,thehighestrate(44.26%)wasdetectedin1-3yearsoldchildren.Therewere4strains(13.33%)forHAdV-3, 6strainsforHAdV-7(20.00%)ofBsubgroup,5strains(16.66%)forHAdV-1, 8strains(26.67%)forHAdV-2, 3strains(10.00%)forHAdV-5, 4strains(13.33%)forHAdV-6ofCsubgroup.ThephylogenetictreeformedtwoindependentbranchesandCsubgroupgraduallybecameadvantage.ConclusionsHumanadenovirushadobviousseasonalcharacteristicsinWuxiareaduring2011- 2013,mainlyinwinterandspring; 1-3yearsoldchildrenwerethemainsusceptiblepopulation.SixtypesofBandCsubgroupswerethedominantepidemicstrains,withtheepidemictendencytransformedfromsubgroupBtoC.

HumanAdenovirus；EpidemiologicalCharacteristics；Genotype

凌霞，Email：mgy2004165@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.010

人腺病毒；流行特征；基因型

無錫市科技局支持項目(CSE31N1430)

2016-06-06)