LPS和R848對Tfh細胞表達Ki67和BcL6以及CXCR5的影響

黃磊 傅庭煥 李林 許文 譚向龍 聶為民 周先志 貌盼勇

100853 北京，解放軍醫學院(黃磊、譚向龍、貌盼勇)；100039 北京，解放軍第三○二醫院(黃磊、聶為民、周先志、貌盼勇)；100048 北京，解放軍總醫院第一附屬醫院(傅庭煥)；100071 北京，軍事醫學科學院(李林)

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·論著·

LPS和R848對Tfh細胞表達Ki67和BcL6以及CXCR5的影響

黃磊 傅庭煥 李林 許文 譚向龍 聶為民 周先志 貌盼勇

100853 北京，解放軍醫學院(黃磊、譚向龍、貌盼勇)；100039 北京，解放軍第三○二醫院(黃磊、聶為民、周先志、貌盼勇)；100048 北京，解放軍總醫院第一附屬醫院(傅庭煥)；100071 北京，軍事醫學科學院(李林)

目的 評估HIV感染及感染后微生物易位對濾泡輔助T淋巴細胞(T follicular helper cells，Tfh)功能的影響。方法 選取非HIV感染者外周淺表淋巴結(Lymph nodes,LNs)，分離淋巴細胞，在存在或不存在HIV感染情況下，分別以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和R848刺激；采用流式細胞術檢測Tfh細胞表達Ki67、BcL6和CXCR5情況。結果 LPS和R848刺激可促使Tfh細胞擴張并高表達BcL6，與LPS比，R848起效晚，但效果更強。雖然LPS可協助HIV抑制Tfh細胞表達BcL6，但HIV-1可能才是Tfh細胞下調BcL6表達的根本原因。此外，LPS和R848刺激可導致Tfh細胞下調CXCR5表達，使Tfh細胞接受CXCL13趨化定位的能力降低。結論 HIV感染是導致Tfh細胞功能異常的根本原因，但消化道微生物產物的漏入可能在感染后Tfh細胞功能異常中，起到了協同增效作用。因此，抑制感染后微生物產物易位，可能改善感染者體液免疫功能。

濾泡輔助T淋巴細胞(T follicular helper cells, Tfh)是一個特殊的CD4+T淋巴細胞亞群，定居在淋巴結(lymph nodes, LNs)的B細胞淋巴濾泡中，對生發中心(germinal center, GC)抗原特異性B細胞的生存、增生、分化以及抗體類型轉換起著關鍵性的輔助作用[1]。因此，Tfh細胞的正常功能對于疫苗的設計非常重要。同時，Tfh細胞也在自身免疫性疾病中，扮演著重要角色[2]。近年研究發現， Tfh細胞對HIV非常易感，但其數量并沒有因為感染而減少，反而增加了[3]。HIV感染后Tfh的異?？赡軐е铝梭w液免疫受損。研究發現其數量與GC中B細胞的數量正相關，但與記憶性B細胞負相關[3]。HIV感染導致消化道免疫和物理屏障受損，消化道微生物產物大量入血[4]。但是，目前對微生物產物易位是否會導致Tfh細胞的擴張和功能改變仍不清楚。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性細菌細胞壁中的一種成分，而R848是一種模擬源性病毒的單鏈 RNA 分子。為了闡述慢性HIV感染中，病原微生物產物對Tfh的影響，我們從非HIV感染者外周淺表LNs中分離淋巴細胞，以LPS、R848刺激或HIV-1感染加LPS、R848刺激作用于淋巴細胞，并檢測Tfh細胞表達Ki67、CXCR5及BCL6的改變，以期為理解HIV感染中Tfh細胞功能及體液免疫的改變有所幫助。

1 材料與方法

1.1 患者和組織標本 解放軍第302醫院及解放軍總醫院第一附屬醫院2013至2015年就診患者中，留取因外周淺表LNs腫大行活檢的非HIV感染者的LNs。將LNs分為兩部分，一部分4%多聚甲醛固定、石蠟包埋，另一部分用于分離淋巴細胞。石蠟包埋的LNs經常規切片，HE染色后，選取其中經臨床和病理證實排除腫瘤和感染的病例20例(頸部2例、腋窩3例，腹股溝15例)，將分離的淋巴細胞進行下一步實驗?；颊咧形荒挲g為34歲(16歲-49歲)，其中男性12例、女性8例。常規手術留取LNs前均簽訂知情同意書，并經醫院醫學倫理委員會審核通過。

1.2 LNs中淋巴細胞的分離 常規手術方法取LNs后，將其四分之三部分放于孔徑150 μm 的細胞篩網上，用常規方法研磨、分離淋巴細胞[5]。

1.3 HIV-1(X4嗜性)質粒的轉染 HIV-1(X4嗜性)質粒為中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心惠贈。將293T細胞(約5×107個)按1∶4體積比加入RPMI-1640培養基，接種于培養皿(直徑10 cm)中，總體積20 ml。次日，按上述體系再傳代1次。隨后將HIV-1(X4嗜性)質粒(相當24 μg的DNA)加入1.5 ml Opti-MEMⅠ培養基中，混勻后，將60 5 μl的 lipofectamine TM 2000加入其中，孵育5 min?；旌舷♂尩馁|粒DNA和lipofectamine TM 2000，輕搖并室溫孵育20 min。隨后將混合物加入到293T細胞的培養皿中混勻，37 ℃的CO2孵育箱孵育48 h，收取上清。

1.4 淋巴細胞的刺激 將新鮮分離的淋巴細胞計數后，立即接種在6孔板中，每孔2×105個細胞。分別加入LPS(20 ng/ml)和R848(1 μg/ml)。每種刺激劑各兩孔，分別培養5 d和8 d后，加入胰蛋白酶消化后，重新用PBS懸浮，留待下一步流式細胞染色用。以上實驗共使用LNs10枚。

HIV-1(X4嗜性)感染淋巴細胞基本實驗步驟同上。鑒于HIV-1感染所導致的細胞損失，每孔加入3.5×105個細胞。分為HIV組、HIV+LPS組和HIV+R848組。每組各兩孔，分別培養5 d和8 d。HIV-1(X4嗜性)DNA濃度為150 ng/ml。以上實驗共使用LNs10枚。每組均以不加任何刺激劑、培養相應時間的淋巴細胞作為對照。

1.5 流式細胞檢測 將刺激或感染后的淋巴細胞重新懸浮于PBS中，進行細胞計數，保證細胞濃度>2.5×105/ml，取200 μl細胞懸液置于流式管中，根據不同染色方案，常規進行細胞表面抗CD3、抗CD8、抗CD45RO、抗CXCR5、抗PD1染色后，加入200 μl PBS重懸，以穿膜試劑盒(eBioscience公司)按操作說明進行穿膜，加入抗Ki67、抗BcL6流式抗體染色后，立即上流式細胞儀(美國BD公司 FACScanto型)。因HIV-1感染會導致CD4下調， 以CD3+CD8-代表CD4+T淋巴細胞，故Tfh細胞圈門策略為CD3+CD8-CD45RO+, CXCR5+PD1+(圖1)。

a 圈出淋巴細胞，b 以CD3陽性，CD8陰性定義CD4+T淋巴細胞，c 從CD4+T淋巴細胞進一步選出CD45RO+CD4+T淋巴細胞，d 選出前者中CXCR5+PD1+細胞，即為Tfh細胞。圖1 Tfh細胞圈門策略a Gatng lymphocytes, b Defining CD4+T Cells as CD3+CD8- cells from lymphocytes, c Choosing CD45RO+ cells from the former, d Gating CXCR5+PD1+ from the former as Tfh cellsFig.1 Gate strategy of Tfh

a 刺激5 d后Tfh表達Ki67的變化，b 刺激8 d后Tfh表達Ki67的變化圖2 LPS和R848對Tfh細胞增生的影響a The alteration of Ki67 expression in Tfh after 5 days of stimulation. b The alteration of Ki67 expression in Tfh after 8 days of stimulationFig.2 Contribution of LPS and R848 to proliferation of Tfh

2 結果

2.1 LPS和R848的刺激對Tfh細胞增生的影響 Ki67是一個細胞增殖的標記物。為了LPS和R848對Tfh細胞增生的影響，我們檢測了被LPS和R848刺激5 d、8 d后，LNs分離淋巴細胞中Tfh細胞表達Ki67的情況。結果顯示，第5天時，LPS刺激組Tfh表達Ki67水平(21.9±3.97)明顯升高，與對照組(7.16±1.89)和R848組(9.16±3.19)組相比，差異均有統計學意義(P<0.05)，而R848刺激組表達水平雖較對照組高，但差異無統計學意義(P=0.497)；在第8天時，LPS組(21.15±5.18)和R848組(36.6±3.62)Tfh表達Ki67水平均顯著升高，與對照組(12.56±2.83)相比，差異均有統計學意義(P<0.05)，R848組表達水平也較LPS組高，差異有統計學意義(P<0.05)(圖2)。

2.2 LPS和R848的刺激對Tfh細胞表達BcL6的影響 第5天時，LPS組(67.98±10.7)和R848組(60.53±6.7)Tfh細胞BcL6表達水平顯著升高，與對照組(43.28±6.82)比差異均有統計學意義(P<0.05)，與R848組比，LPS組表達更高，但差異無統計學意義(P=0.17)；第8天， R848組(89.43±6.83)BcL6表達升高最顯著，與對照組(52.33±7.94)和LPS組(60.63±7.93)比差異均有統計學意義(P<0.05)，雖然LPS組比對照組表達水平高，但差異無統計學意義(P=0.063)(圖3)。

a 單純刺激5天后Tfh表達BcL6的變化，b 單純刺激8 d后Tfh表達BcL6的變化，c 感染并刺激5 d后Tfh表達BcL6的變化，d 感染并刺激8 d后Tfh表達BcL6的變化圖3 HIV-1、LPS和R848對Tfh細胞BcL6表達的影響a The alteration of BcL6 expression in Tfh after 5 days of stimulation. b The alteration of Bcl6 expression in Tfh after 8 days of stimulation. c The alteration of BcL6 expression in Tfh after 5 days of stimulation along with infection. d The alteration of Bcl6 expression in Tfh after 8 days of stimulation along with infectionFig.3 Contribution of HIV-1, LPS and R848 to BcL6 expression of Tfh

2.3 HIV-1感染及LPS和R848的協同作用對Tfh細胞表達BcL6的影響 用HIV-1X4嗜性病毒株感染LNs分離的淋巴細胞，同時給予LPS或R848刺激，結果表明：無論是在第5天(30.66±6.11)或是第8天(32.85±4.73)，HIV-1單純感染組Tfh細胞的BcL6表達，與對照組(分別為48.67±6.29，53.99±6.31)相比差異均有統計學意義(P<0.05)；與單純LPS刺激相反，HIV-1+LPS組均顯著降低了Tfh細胞BcL6的表達，但僅在第5天時(15.02±5.07)與HIV-1單純感染組相比差異有統計學意義(P<0.05)，8 d時(25.2±7.21)差異并無統計學意義(P=0.128)，與對照組相比差異均有統計學意義(P<0.05)；刺激5 d和8 d后，HIV-1+R848組的Tfh細胞BCL6的表達與對照組比均顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)，但與單純HIV-1感染組相比差異無統計學意義(P=1.0)，與HIV-1+LPS組相比僅刺激5 d時差異有統計學意義(P<0.05)(圖3)。

a 刺激5 d后Tfh表達CXCR5的變化，b 刺激8 d后Tfh表達CXCR5的變化圖4 LPS和R848對Tfh細胞CXCR5表達的影響a The alteration of CXCR5 expression on Tfh after 5 days of stimulation. b The alteration of CXCR5 expression on Tfh after 8 days of stimulationFig.4 Contribution of LPS and R848 to CXCR5 expression of Tfh

2.4 LPS和R848的刺激對Tfh細胞表達CXCR5的影響 刺激后第5天，LPS組(153.3±34.43)和R848組(133.51±19.97)的Tfh細胞CXCR5表達水平下降，與對照組(751.49±62.66)相比，差異均有統計學意義(P<0.05)，LPS組與R848組相比差異無統計學意義(P=0.933)；刺激后第8天與刺激5 d相似，LPS組(166.42±52.88)和R848組(184.02±43.77)CXCR5表達下降，與對照組(829.28±48.95)相比，差異均有統計學意義(P<0.05)，而LPS組與R848組相比差異無統計學意義(P=1.0)(圖4)。

3 討論

抗體可通過多種機制阻止病毒進入宿主細胞，清除感染細胞，在抗病毒感染中發揮著重要作用。然而，HIV卻進化出一套精密的機制逃避中和抗體反應，繼而導致感染慢性化[6]。同時，HIV還可影響抗體反應的質量，表現為慢性HIV感染中的高γ球蛋白血癥，對蛋白疫苗反應能力下降，和抗原特異性記憶B細胞減少[7]。近期的一些研究發現慢性HIV感染中， Tfh細胞在HIV感染者淋巴濾泡中的聚集，以及功能改變可能是HIV逃脫體液免疫的基礎[3]。

B細胞接受同源Tfh細胞的輔助后，經兩條不同的途徑分化為分泌抗體細胞。濾泡外途徑主要產生短壽命、低親和力漿細胞。而濾泡內途徑主要發生在GC，在此進行抗體親和力突變反應，獲得選擇性競爭優勢的B細胞在Tfh細胞的輔助下，最終分化為長壽命記憶性B細胞或記憶性漿細胞[8]。根據BCL6表達水平，Tfh細胞可以分為兩個亞群，低表達BCL6的Tfh細胞，通常被稱為前體Tfh細胞，和高表達BCL6的GC Tfh細胞。前體Tfh細胞主要定居于濾泡或毗鄰濾泡的區域，僅為B細胞能提濾泡外輔助，而GC Tfh細胞定居于GC內，對于GC的發育和B細胞的選擇至關重要[9，10]。與前體Tfh細胞相比，GC Tfh細胞表達更高的CXCR5、PD1、ICOS和CXCL13，分泌更多的IL-21。BcL6是Tfh細胞分化的主要調控者，可通過拮抗Blimp-1促使CD4+T淋巴細胞向Tfh細胞方向分化[11]。CXCR5是CXCL13的配體，可以表達于Tfh細胞和B細胞表面。

我們的實驗結果顯示，雖然LPS和R848刺激可以促進Tfh細胞的擴張，上調Tfh細胞BcL6的表達，但是在非HIV-1感染條件下這些刺激卻導致了CXCR5下降，這意味著Tfh細胞接受CXCL13趨化定位于淋巴濾泡中的能力降低。同時,HIV-1感染可以抑制Tfh細胞表達BcL6，而LPS在HIV-1感染條件下可以增強這種效應，因此可協同HIV-1下調BcL6表達。此外，根據刺激5 d和刺激8 d時Ki67和BcL6表達情況，表明R848對Tfh細胞的刺激作用較LPS起效晚，但作用效果更強。上述結果提示，在HIV-1感染條件下，微生物產物所導致的Tfh細胞的擴張，但并沒有催生大量GC Tfh細胞的產生，而是誘導非GC Tfh細胞擴張。這種擴張的最終結果導致了體液免疫的質量下降。

總之，我們的研究結果提示，HIV感染后消化道微生物產物的漏入可能刺激了Tfh細胞的擴張，但同時導致了其功能的受損，HIV本身可能是導致Tfh細胞功能異常的根本原因。因此，抑制感染后大量微生物產物的易位，可能改善感染者體液免疫功能。

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Impact of LPS and R848 stimulating to Ki67, BcL6 and CXCR5 expression of T follicular helper cells

HuangLei,FuTinghuan,LiLin,XuWen，TanXianglong,NieWeimin,ZhouXianzhi,MaoPanyong

MedicalschoolofChinesePLA,Beijing100853,China(HuangL,TanXL,MaoPY);PLA302Hospital,Beijing100039,China(HuangL,NieWM,ZhouXZ,MaoPY);FirstAffiliatedHospitalofPLAGeneralHospital,Beijing100048,China(FuTH)；AcademyofMilitaryMedicalSciences，Beijing100071，China(LiL)

ZhouXianzhi,Email:zxz.302@163.com；MaoPanyong,Email:maopy302@163.com

Objective To evaluate the possible impact of HIV infection and microbic products on the function of T follicular helper cells(Tfh). Methods Lymph nodes of non-HIV infected individuals were recruited, and then ground gently and isolated into single lymphocytes. Ki67, BcL6 and CXCR5 expressions of Tfh were determined by flow cytometry after stimulation of lipopolysaccharide(LPS) and R848, or along with HIV-1 infection, respectively. Results The stimulation of LPS and R848 induced the expansion and BcL6 expression of Tfh. These effects of R848 started late but were stronger comparing to LPS. HIV-1 was intrinsic reason which downregulated the expression of BcL6 in Tfh, but LPS played a synergetic role in that. Moreover, the stimulation of LPS and R848 also downregulated the expression of CXCR5 in Tfh surface, which could impeded the ability of Tfh locating in lymphoid follicle. Conclusions HIV is the intrinsic reason which results in the abnormal function of Tfh, but the translocation of microbic products play a synergetic role. Therefore, inhibiting the translocation of microbic products could improve the adaptive immunity of host.

Aequired immunodeficiency syndromes; Acquired immunodeficiency syndrome; T follicular helper cells; lymph nodes; lipopolysaccharide

周先志，Email：zxz.302@163.com；貌盼勇，Email: maopy302@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.005

獲得免疫缺陷綜合征；艾滋??；濾泡輔助T淋巴細胞；淋巴結；脂多糖

2016-03-21)