急性心肌梗死患者內臟素mRNA基因表達及臨床相關性的研究

何皓+黃海峰+符福強+李筱敏+徐曉云

【摘要】 目的：探討急性心肌梗死患者內臟素基因在脂肪組織中表達情況，以及內臟素mRNA基因表達與患者臨床相關性研究，為急性心肌梗死患者防治提供新的方法。方法：根據臨床診斷標準將80例急性心肌梗死患者作為急性心肌梗死組，將100例正常人作為對照組。用RT-PCR方法檢測內臟素mRNA的水平和基因的表達水平，并同時收集比較兩組的臨床檢查數據指標。結果：急性心肌梗死患者組的血清內臟素濃度及脂肪組織中的內臟素mRNA基因表達均高于對照組（P<0.05）。急性心肌梗死患者脂肪組織的mRNA的表達量與WHR、膽固醇、甘油三酯均呈正相關性（P<0.05）。急性心肌梗死患者內臟素的量與機體臨床的甘油三酯、膽固醇、LDL-C均呈正相關性（P<0.05）。結論：急性心肌梗死患者中內臟素基因與濃度表達增高，可能是急性心肌梗死的一個獨立危險因素。

【關鍵詞】 急性心肌梗死； 內臟素； mRNA基因表達； 脂肪組織

【Abstract】 Objective：To investigate the expression of mRNA gene in the adipose tissue of patients with acute myocardial infarction，and to provide a new method for the prevention and treatment of patients with acute myocardial infarction.Method：According to the criteria of clinical diagnosis，80 patients with acute myocardial infarction were enrolled as acute myocardial infarction group， and 100 normal people were served as control group.RT-PCR method was used to detect the level of mRNA and the expression level of gene，and the clinical data of the two groups were collected and compared.Result：The plasma visfatin level and the quantitaitive of visfatin mRNA expression adipose tissues of acute myocardial infarction of patients were significantly higher than those in control group（P<0.05）.The expression of mRNA in adipose tissue of patients with acute myocardial infarction was positively correlated with WHR，TG，TC（P<0.05）. The amount of internal organs in patients with acute myocardial infarction was positively correlated with the clinical TG，TC，and LDL-C（P<0.05）.Conclusion：In patients with acute myocardial infarction， the increased expression of the internal organs and the concentration of the internal organs may be an independent risk factor for acute myocardial infarction.

【Key words】 Acute myocardial infarction； Visfatin； mRNA expression； Adipose tissues

First-authors address：Nanhai Hospital of the Southern Medical University，Foshan 528200，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.30.003

急性心肌梗死屬于急性冠脈綜合征一種類型，急性心肌梗死有急性ST段抬高性心肌梗死和急性非ST段抬高性心肌梗死，臨床上發病急、死亡率高，而心肌梗死發病證明與許多的機體內細胞因子有關，內臟素就是其中的一種，日本學者Fukuhara在2005年研究中發現了它，許多的研究證明內臟素來源機體內各種脂肪組織，不同的是有的人認為來源腹部脂肪，有的人認為來源內臟脂肪。歐美的科學家研究證明內臟素作為一種脂肪分泌細胞因子，是一種能夠降低機體中血管血液血糖值的擬胰島素活性的物質，同時也能促進機體體內的各種脂肪組織的合成與聚集，尤其與腹部脂肪的分布關系密切，后來的研究同時也證明內臟素合成與分泌同機體體內的血管內皮細胞的炎癥反應有關，所以認為其可能參與心肌梗死患者的心臟冠狀動脈的炎癥反應，推斷可能和急性心肌梗死患者發生和發展有關[1]。目前該方向的研究在國內國外不多，且爭議太多，但是內臟素是如何造成急性梗死患者的冠脈血管炎癥反應，仍需要更多的研究和實驗去證明。本研究通過測定急性心肌梗死患者內臟素的血清水平及基因表達，來分析急性心肌梗死患者發生與發展是否與患者的脂肪組織分泌的內臟素存在某種必然的聯系[2]。筆者大膽假設：內臟素可以造成急性心肌梗死發生，針對內臟素的控制則有可能成為急性心肌梗死患者的預防及治療的新靶點，從而減少一部分急性梗死患者發生?，F階段，國內外研究這方面的不多，尤其在急性心肌梗死方面研究是空白。所以本課題組第一次在進行內臟素基因在中國漢族人群分布研究，分析急性心肌梗死患者內臟素在機體的表達研究，以及與臨床檢查結果等相關性研究，來為急性心肌梗死患者提供一種可能的新的預防及治療方法，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1月-2015年4月在南方醫科大學南海醫院腹外科100例膽石癥患者作為對照組，排除一切臨床心腦血管病患者；另選取2013年12月-2015年4月在廣東省人民醫院及南方醫科大學南海醫院急性心肌梗死患者80例作為急性心肌梗死組，患者均經心肌酶三項、肌鈣蛋白、心電圖、動態心電圖及冠狀動脈造影的結果確診。排除惡性腫瘤、血液病、各種急慢性炎癥期、各種急慢性心、腦血管病及其他相關的內分泌疾病。

1.2 方法

1.2.1 標本留取 急性心肌梗死的患者急診抽取靜脈血5 mL，膽石癥患者在術晨抽取空腹靜脈血5 mL，在醫院實驗室高速離心機中分離研究對象的血清，分離出來的血清標本立即送檢驗科予FINS、血糖、FBG、甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸等基本臨床指標測定，另一管保存在南方醫科大學南海醫院-80 ℃專用試驗冰箱內，并分批次送廣東省人民醫院分子生物試驗室測內臟素mRNA的水平。急性心肌梗死患者在股動脈穿刺時取腹部脂肪或冠脈搭橋時取脂肪組織液氮迅速凍存，對照組膽石癥患者手術時取皮下脂肪或大網膜脂肪液氮迅速凍存，用于研究內臟素RNA提取。

1.2.2 RNA提取 用通用的TRIZOL法提取，在實驗室用紫外發光光度計測定內臟素RNA濃度和含量。

1.2.3 內臟素基因的mRNA表達水平檢測步驟 （1）研究對象內臟素基因引物的設計與合成：研究采用半定量RT-PCR方法擴增目的基因，實驗對照內參照肌動蛋白基因（β-actin）。然后在PUBMED上以Genebank基因庫上發布的人內臟素基因與β-actin基因的作為序列，利用國際通用的引物軟件（Primer-5）設計引物。筆者得出的β-actin的兩條基因擴增引物基因序列分別為5-CAGCACTGTGTT GGCGTACA-3及5-GCTATCCAGGCTGTGCTATC-3，擴增后基因產物的長度為495 bp。而另一個Visfatin基因的擴增引物為5-TTACATACA CACAAC ACACACCC-3，5-GCCGATTATCTTTACATAGGACG-3，基因擴增后產物為片斷228 bp基因片段。（2）第二階段，研究對象目的基因cDNA的合成：采用PROMEGA公司生產的逆轉錄試劑盒將特定目的的RNA逆轉錄合成，形成研究對象目的基因的cDNA。（3）第三階段，采用聚合酶鏈反應（PCR）合成所需要的研究需要的第二條鏈，聚合酶鏈的反應體系物質如下：dNTP 2 μL（2.5 mmol/L）及β-actin基因上、下游引物各1.0 μL、Visfatin基因上下游引物各1.0 μL、

10×緩沖液Buffer（含氯化鎂）5 μL、Taq酶

0.5 μL（2.5 U）、目的cDNA 2 μL、ddH2O 36.5 μL。研究的PCR的熱循環條件及參數：首先預變性1 min（在94 ℃高溫），反應物質變性30 s（在94 ℃高溫），變性后產物退火30 s（54 ℃），在72 ℃溫度時產物再延伸1 min，反復重復上述的循環，30次后，最后一次循環后在72 ℃徹底延伸時間為4 min，最后完成產物的PCR。（4）筆者把所得PCR的產物，放在自制的2%瓊脂的糖凝膠電泳平板上進行PCR產物的電泳，電泳后結果最后放在美國gene電泳凝膠成像機器上觀察，并用數碼照相機把觀察的結果的圖像進行攝像，并保存原始數據，筆者采用標準β-actinDNA條帶灰度及內臟素DNA條帶灰度對比計算[6]。（5）所有試驗對象的血清內臟素的測定采用美國專用內臟素專用試劑盒，在實驗室專人化學發光法測定。FINS、血糖、FBG、甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸等各種臨床數據生化指標測定采用放免法測定得出。（6）血清內臟素的測定，采用美國試劑盒，化學發光法測定。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，臨床相關性的數據與急性心肌梗死的相關系分析采用多元回歸相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組的臨床及實驗室數據比較 急性心肌梗死患者組的機體內的內臟素濃度、胰島素抵抗指數（HOMA-IR）、體重指數、血清甘油三酯、血清膽固醇、LDL-C、FFA（游離脂肪酸）均高于正常手術的對照組（P<0.05）；而急性心肌梗死與正常手術對照組的年齡、性別、血壓、高密度脂蛋白、FINS比較，差異均無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.2 兩組內臟素脂肪組織中的分泌的內臟素RT-PCR的量比較 急性心肌梗死患者脂肪組織的RT-PCR的內臟素mRNA的表達量為0.713±0.041，明顯高于對照組內臟素mRNA的表達量為0.532±0.036，差異有統計學意義（P<0.01）。

2.3 急性心肌梗死患者脂肪組織的mRNA的表達量及內臟素的濃度多元回歸相關性分析 急性心肌梗死患者內臟素的量與機體臨床的甘油三酯、膽固醇、LDL-C等血脂指標均呈正相關性（OR=1.53、1.43、1.36，P<0.05），而與一般的臨床年齡、性別、血壓、FINS、HDL-C、HOMA-IR無相關性（OR=0.9，P>0.05）。急性心肌梗死患者脂肪組織的mRNA的表達量與WHR、膽固醇、甘油三酯呈正相關性（OR=1.57、1.33、1.52，P<0.05）。急性心肌梗死患者脂肪組織的mRNA的表達量與HDL-C、LDL-C無明顯的相關性（OR=0.9，P>0.05）。

3 討論

改革開放以來，急性心肌梗死已成為影響人類生活質量的一類常見病、多發病，同時，伴隨著相關的疾病如肥胖和糖尿病代謝類疾病的增加，心血管的危重癥發病也大大的升高。研究證明許多的細胞因子參與心肌梗死的形成，內臟素就是其中一種。內臟素由日本的學者發現的，主要是由人體體內及動物脂肪組織所分泌出來的具有許多生物活性的脂肪細胞因子，以前的許多研究證明其的分泌與生物活性與機體內血管內皮細胞炎癥反應有著密切的關系[1-4]。眾所周知，急性心肌梗死在許多的研究中也證明其與心臟冠狀動脈血管內皮細胞炎癥反應及不穩定斑塊的形成有關，因此筆者推斷其內臟素的分泌及水平可能和急性心肌梗死患者的發病有關[5-7]。目前在國內外研究中關于這方面的論述不多，內臟素雖然具有多種機體上的生物學效應，但是其在一系列代謝疾病中病理作用的生理機制研究不是十分清楚，這方面的研究也不多。本研究擬通過分析急性心肌梗死患者的內臟素基因表達水平，來分析其與臨床各項指標的關系及可能存在的機制，揭示急性心肌梗死患者發生與發展是否與機體內內臟素的基因及分泌水平存在一定的關系。

日本的Fukuhara等科學家在實驗的同時也發現機體血清內臟素的量越高，機體的內臟脂肪細胞就越豐富，但是卻與機體皮下脂肪組織變化不大，而相反的是科學家Arike的研究卻證明越是肥胖的人，機體內臟脂肪內內臟素的表達量相應的增多，證明它與肥胖是一定的相關性的[8-9]，而相矛盾的是科學家Hammarstedt等[10]卻在最近的研究沒有發現內臟素在體內脂肪組織中表達增多的現象，沒有發現它們之間有什么關系，為什么會有如此相互矛盾的地方，本文的研究結果是在急性心肌梗死組中脂肪組織的mRNA的表達量明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.05），急性心肌梗死患者內臟素的濃度與年齡、性別、血壓、FINS、HDL-C、HOMA-IR無關，與臨床上血脂數據如膽固醇、甘油三酯、LDL-C呈正相關性。同時急性心肌梗死患者檢測出來的內臟素mRNA的RT-PCR數值與WHR、膽固醇、甘油三酯呈正相關性，而臨床血脂的另兩個指標HDL-C、LDL-C與急性梗死組大網膜脂肪組織的mRNA的表達量卻沒有明顯的相關性。所以筆者發現試驗中急性心肌梗死患者血清中內臟素的濃度高于正常對照組，以及發現急性心肌梗死患者內臟素mRNA的RT-PCR數值也同樣升高，本文的研究結果與2014年河北醫學發表冠心病的內臟素的研究有相似結論，但是測重點又不相同。不同的是他們研究對象是一般的冠心病，相對病情輕[11]，而本文研究的是急性ST段抬高型和非ST段抬高型心肌梗死患者，一般都有心肌酶學的升高，但是由于他們選擇的冠心病標本比較容易收集，收集數據大大多于本文，所以和本文的試驗還是有很大的不同。為什么會出現這樣的結果，筆者分析分泌出來的內臟素可能在血管內發揮其生物活性，它不僅能像胰島素一樣通過發揮作用來降低機體血糖，還可以在機體內促進不同部位器官血管脂肪的合成與聚集，在血管壁促進吞噬細胞形成泡沫細胞，泡沫細胞和血小板及一些炎癥細胞構成血管壁粥樣硬化及脂質斑塊的形成，一些不穩定的斑塊在特殊情況下容易脫落下來形成急性心肌梗死，造成血管的阻塞。同時內臟素能直接作用機體組織血管的血管內皮細胞，通過分子通路引起血管內的內皮細胞各種功能代謝出現障礙，血管內皮細胞的不斷損傷而出現血管的狹窄，上述的種種細胞及組織的破壞及修復最終成為急性心肌梗死患者的發生和發展的啟動因素及決定的因素[12-13]。

綜上所述，本文研究證明，內臟素在急性心肌梗死患者起病中及疾病的發展中有著十分重要的角色。這也許為日后急性心肌梗死患者的預防和治療有一個新的方法，一個新的突破點。同樣如何利用急性心肌梗死患者的內臟素基因來控制機體內臟素的分泌，以及分泌出來的內臟素在機體內如何作用于血管的內皮細胞，從而對冠脈的血管造成損傷，這些機制都在急性心肌梗死疾病的發生和發展起一定的作用，甚至可以推斷控制內臟素分泌也許在早期預防急性心肌梗死患者能夠起到十分重要的作用。但是如何去控制內臟素病理作用的這方面研究不多，這需要進行下一步的研究探討，以發現更好的辦法減少急性心肌梗死事件的發生。

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（收稿日期：2016-06-27） （本文編輯：郎威）