雙報告基因標記乳腺癌細胞移植瘤模型的建立及活體成像研究

周曼倩++閻皓++尹曉東++王輝

摘要：目的 探索雙報告基因標記技術用于建立乳腺癌小鼠移植瘤模型并進行活體成像研究的可行性。方法 利用慢病毒轉染技術將綠色熒光蛋白（eGFP）和熒光素酶（Fluc）融合基因標記人乳腺癌MDA-MB-231細胞，利用流式細胞術篩選建立穩定細胞系，利用熒光顯微鏡和流式細胞術檢測轉染率，體外細胞成像檢測Fluc的表達；將轉染后的231細胞接種至NOD/SCID小鼠皮下建立移植瘤模型，活體成像監測移植瘤Fluc的發光。結果 熒光顯微鏡下觀察建立的穩定細胞系中GFP表達率高，流式測定表達率95.2%，傳代擴增5次后表達率無明顯變化。體外細胞成像檢測到明顯的Fluc發光，信號強度與細胞數成正比。所有實驗小鼠均接種成功，可觀察到Fluc信號強度隨時間逐漸增強。結論 慢病毒介導的Fluc-eGFP雙報告基因標記可用于體內移植瘤活體成像，為乳腺癌相關機制及治療研究提供了直觀，準確的平臺。

關鍵詞：熒光素酶；綠色熒光蛋白；活體成像；乳腺癌

近年來新興的活體成像技術為生物醫學研究提供了新的平臺。其可從細胞或亞細胞水平對體內的生物學過程進行直觀觀察和量化分析，具有操作簡單，靈敏度高，無創性，觀測結果的直觀性和連續動態性等特點[1-2]ENREF1。 相對于熒光素酶生物發光成像較強的特異性和高信噪比，熒光成像應用于活體內時因其需要激發光源而造成較強的背景噪音，靈敏度較低，而用于體外細胞及組織標記具有一定優勢。利用熒光蛋白和熒光素酶對細胞或動物進行雙重標記，前者可用于體外檢測和細胞生物學觀察，后者用來進行活體動物體內追蹤研究[3-4]ENREF1。本研究構建了穩定表達螢火蟲熒光素酶-綠色熒光蛋白（Fluc-eGFP，DF）的人乳腺癌MDA-MB-231細胞系，并在NOD/SCID小鼠建立乳腺癌皮下移植瘤模型，并應用活體成像示蹤監測標記的乳腺癌細胞在小鼠體內的分布、存活及增殖。

1資料與方法

1.1一般資料 細胞，質粒和實驗動物：人乳腺癌MDA-MB-231細胞系購自ATCC，人胚腎細胞系293T， Flu-eGFP慢病毒表達質粒（圖1）由南開大學醫學院免疫學實驗室惠贈。6～8周齡健康NOD/SCID雌性小鼠，購自北京大學醫學部實驗動物科學部，飼養于SPF級環境。

1.2試劑及儀器 DMEM 培養基，Fluc底物luciferin，活體成像設備（IVIS 200），流式細胞儀。

1.3方法

1.3.1慢病毒的包裝 將生長旺盛的293T細胞以1*106的密度接種在6孔板內。細胞密度達到90%融合度進行轉染。將轉染試劑和三種慢病毒包裝質?；旌?，靜置20 min后加入293T細胞培養孔內，4 h后添加2 ml全培養基，16 h后換液，換液24 h后收集病毒上清。

1.3.2慢病毒感染MDA-MB-231細胞及陽性細胞的篩選 將231細胞以10%的密度接種在六孔板內，加入1ml慢病毒上清，2 ml DMEM培養基，24 ug Polybrene。常溫下1600 r/min離心1 h。換成全培養基培養擴增。用流式分選出GFP表達陽性的細胞群。熒光顯微鏡觀察GFP的表達情況。

1.3.3 Fluc-eGFP標記的MDA-MB-231細胞GFP和Fluc表達分析 利用流式細胞術檢測構建的231-DF細胞系中GFP表達率。231-DF細胞消化后分別以不同梯度的細胞密度接種入6孔板內。培養1 d后應用活體成像儀檢測Fluc的表達。成像時向6孔板每個孔內加入500 ul底物溶液（1：100稀釋），掃描時間1 s。用living imaging 軟件分析處理數據。

1.3.4小鼠皮下移植瘤模型的建立 將培養的狀態良好的231-DF細胞消化，制備單細胞懸液，調整細胞數為2×107/ml，用水合氯醛麻醉小鼠，100 ul上述細胞懸液注射至小鼠兩側肩部皮下。

1.3.5活體成像監測移植瘤的生長狀況 自接種第2 d起，每7 d應用活體成像檢測接種小鼠體內Fluc發光信號，研究移植瘤的生長情況。每只小鼠成像前腹腔注射200 ml的熒光素酶底物，氣體麻醉后放入樣本暗箱內成像，掃描時間30 s。

2結果

2.1慢病毒感染231細胞及陽性細胞的篩選 熒光顯微鏡下觀察231細胞轉染率在80%左右。流式分選出GFP陽性細胞群，GFP表達率在95%左右，經傳代擴增5次后表達率無明顯變化，見圖2。

2.2 231-DF細胞Fluc表達分析 在6孔板連續的5個孔內，隨著細胞密度依次遞增，熒光信號的強度也依次增強（圖3）。說明我們用DF標記的231細胞表達的Fluc蛋白在體外能夠使用活體成像檢測到。以熒光信號強度對細胞數做一線性回歸分析（圖3），R2=0.99，表示熒光強度與細胞數之間存在線性正相關。上述結果提示Fluc的信號強度可作為測定活細胞數的標準。

2.3小鼠皮下接種成瘤及活體成像 NOD/SCID小鼠皮下接種經231-DF細胞約2 w后接種部位出現腫瘤結節，所有實驗小鼠均接種成功，隨時間推移，移植瘤呈圓形或橢圓形生長。于接種第2 d起，成像1次/w，觀察到Fluc信號強度隨時間增強，提示小鼠體內移植瘤的生長（圖4）。

3討論

慢病毒介導的基因轉染能夠使外源性基因整合入宿主細胞基因組內，對轉錄沉默作用有較強的抵抗能力[5]，本實驗中DF基因在MDA231細胞內能得到長期穩定的表達，可準確的反映腫瘤細胞在實驗動物體內的生存狀態。報告基因DF表達eGFP-Fluc融合蛋白，因此可在體外以GFP篩選表達陽性細胞群，建立穩定細胞系。用流式細胞儀進行GFP表達分析，發現連續傳代5次后，GFP陽性細胞的比例維持在95%左右。融合基因的優勢在于既可進行活體內成像研究、也可從體外驗證所標記細胞的分布和功能，結果證明，對于穩定轉染了DF基因的細胞系，活體成像的熒光強度與細胞數成正比。

本研究采用慢病毒轉染技術，建立了穩定表達雙融合eGFP-Fluc蛋白的人乳腺癌MDA-MB-231細胞系，在NOD/SCID小鼠建立乳腺癌皮下移植瘤模型，利用活體成像監測荷瘤小鼠體內腫瘤細胞的存活和增殖。結果提示雙報告基因標記技術為進行體內移植瘤成像提供了較大便利?？捎糜诨铙w成像的小鼠皮下移植瘤模型為乳腺癌相關機制及治療研究提供了直觀，準確的平臺。

參考文獻：

[1]王麗婷，孫瑋，冉?，?，等.活體動物光學成像技術與應用研究[J].醫學信息，2015（1）.

[2]劉靜靜，胡曉俊，李征然，等.Luciferase2/mKate2雙報告基因對小鼠骨髓間充質干細胞的標記及活體光學成像研究[J].中山大學學報（醫學科學版），2014，35（3）.

[3]程凱.荷瘤鼠活體成像研究進展[J].醫學綜述，2011，17（21）.

[4]閆明霞，朱淼鑫，劉蕾，等.實驗性腫瘤細胞轉移動物模型的活體成像觀察[J].實驗動物與比較醫學，2012，32（5）.

[5]蔣凱，韓永健，程龍，等.動物活體成像生物發光穩定細胞株的構建[J].生物技術通訊，2011，22（2）.

編輯/孫杰