雙熒光素酶報告基因系統在家蠶基因啟動子研究中的應用

歐陽萃鴻 陳太生 謝曉樂 李榮松 田 鈴

（華南農業大學動物科學學院 廣東廣州 510642）

啟動子是基因結構中一段可以被RNA 聚合酶識別、結合、起始轉錄的DNA 序列，它含有RNA 聚合酶特異性結合和轉錄起始所需的保守序列。啟動子本身不被轉錄，而是通過其中的反應元件（response elements）與轉錄因子（transcription factor）結合進而控制基因的轉錄活動。轉錄調控是調節基因功能最直接、有效的方式[1]。將目的基因的啟動子區域構建至雙熒光素酶報告基因表達載體中，通過檢測雙熒光素酶報告基因系統熒光蛋白的酶活，從而分析目的基因啟動子的轉錄活性，這是基因轉錄調控研究中常用且有效的手段之一[2]。家蠶是鱗翅目昆蟲的模式生物，本文以家蠶基因啟動子調控機制的研究為切入點，對雙熒光素酶報告基因系統的工作原理與特點、研究和應用現狀進行綜述，有助于我們從細胞和分子層面理解昆蟲生長發育過程的基因轉錄表達調控機制，為今后該系統在昆蟲中的深入應用提供思考。

1 雙熒光素酶報告基因系統的發展歷史

熒光素酶是最初從自然界發光生物中獲得的一種可以催化對應的熒光底物發生氧化反應產生熒光的蛋白酶類物質，哺乳細胞沒有內源性熒光素酶[3]。熒光底物與酶發生反應產生的光其本質是一種生物螢光，屬于可見光，不依賴外源激發光作用，在自然界一些發光生物身上通常能見到這種生物螢光。而熒光則是通過激發光照射熒光物質，光能使熒光物質原子核周圍的電子發生躍遷反應，由原來的低能量電子軌道躍遷到高能量電子軌道，但是這種原子狀態并不穩定，即原子會從激發態回到基態，原先電子從激發光中獲得的能量又會重新以光能的形式釋放出去，形成具有一定的波長特征的熒光。所以熒光和螢光是有一定區別的，Promega 公司為了區分這兩類光信號的不同一直將Luciferase 稱為螢光素酶，但慣例上我們還是稱其為熒光素酶。

地球存在許多發光的生物，如螢火蟲等。在1884年，法國科學家Dubois 經實驗認為，熒光素底物、熒光催化酶以及氧是發光反應的基本條件，由此開始了對螢火蟲發光現象的研究與應用。隨后的數十年內，科學家們不斷地對螢火蟲發光物質本質進行探索和查找。1942年，美國約翰霍普金斯大學麥科勒-普拉特研究所（The McCollum-Pratt Institute and the Department of Biology, Johns Hopkins University）的McElory 發現三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）直接參與了螢火蟲發光反應[4]。1954年，McElory 等人從發光的細菌中提取到了熒光素酶結晶，由此發光生物熒光素酶的研究邁上了新的臺階[5]。隨后在 1956年，Green 與McElory 等一起第一次從螢火蟲中提取得到了較高純度的螢火蟲熒光素酶結晶制劑，自此開始了螢火蟲熒光素酶在生物學研究中的開發和應用[6]。

除螢火蟲類昆蟲外，目前在自然界中已經發現了多種可以發光的生物，人們對這些來源于不同發光生物的熒光素酶進行了提取，并分類為螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase）、細菌熒光素酶（bacterial luciferase）和另外一些從發光甲蟲、發光海洋生物提取的熒光素酶[3]。螢火蟲熒光素酶最早提取于一種北美螢火蟲（Photinus pyralis），目前已在世界各地的螢火蟲中提取到螢火蟲熒光素酶[3]。細菌熒光素酶是從明亮發光桿菌（Photobacterium phosphoreum）、羽田希瓦氏菌（shezoanella hanedai）、夏威夷弧菌（Vibrio harvey）、青?；【╒.qinhaiensis）、火神弧菌（V.logei）、費氏弧菌（V.fischeri）等多種海洋和淡水中的發光菌中提取獲得的。在1960年，美國喬治亞大學（University of Georgia）的Cormier 等研究者從海腎（renilla）中提取了海腎熒光素酶（Renilla reniformisluciferase），為海腎熒光素酶在科研中的應用打下了基礎[7]。

數十年來，研究者們一直嘗試將熒光素酶作為一種報告基因來研究基因啟動子的活性和蛋白質之間的相互作用。早在1988年就有通過對熒光素酶報告基因表達的蛋白的熒光強度進行檢測，進而綜合分析不同處理條件對基因啟動子活性影響[8]。這就是典型的、利用熒光素酶報告基因系統表達產物的特性建立起來的一種可以對目的基因轉錄活性進行定量檢測的技術體系[3]。在1990年，經過兩年的研究與發展形成了一套相對成熟的熒光素酶生物傳感器技術，同年其發明者加入了Promega 公司。經過幾年的潛心研發，1996年Promega 公司正式發布了雙熒光素酶報告基因系統并開始銷售相關檢測試劑，這種技術創造性地結合了螢火蟲熒光素酶和海洋腔腸熒光素酶兩種熒光檢測體系，是熒光素酶技術在漫長發展歷史中的一次重要的突破。雙熒光素酶報告基因系統與傳統共報告基因系統相比較，具有更簡便、高效、快速的特點，因此在分子生物學諸多領域的研究中得到了應用。

2 雙熒光素酶報告基因系統的基本工作原理

理想的報告基因應該具有以下幾個基本特點：①具有已知且可被克隆驗證的全部基因序列；②報告基因的表達產物在檢測中要反應靈敏，酶活反應迅速；③不與目的研究細胞中的任何表達基因相似，否則會干擾轉染進入細胞內的熒光素酶的作用效果[9]；④報告基因的表達產物有較寬的動態檢測范圍，具有良好的穩定性；⑤報告基因的表達產物不影響目的研究細胞的正常生理活動；⑥報告基因在目的研究細胞中的表達產物易于檢測，且能夠按照標準讀取量值。大部分的報告基因表達產物通常是酶，可以通過催化反應級聯放大信號，再以螢光或放射性信號被檢測[10]。

在幾種熒光素酶中，螢火蟲的熒光素酶最適合我們開展實驗研究使用的。大多數細菌的熒光素酶最適的活性溫度在15 ℃～25 ℃，溫度超過25 ℃時其酶活會迅速下降，37 ℃下基本全部失活，所以不適合在動物細胞中使用[11]。相較而言，螢火蟲熒光素酶則對催化溫度要求較低，一般室溫即可，適應溫度范圍廣，因此該酶報告基因常用于各類真核細胞基因啟動子活性的分析與檢測。目前，有些新型熒光素酶如Gaussia 熒光素酶和Cypridina 熒光素酶，它們的基因攜帶了一種分泌信號肽，表達產物能分泌到細胞外，可以在不裂解破碎細胞的條件下直接檢測酶活，甚至還能連續檢測時間曲線上報告基因表達產物的變化，進而分析報告基因的表達活性變化，此技術方法適用于高通量篩選[12]。

螢火蟲熒光素酶是一種可以催化熒光底物發生反應的單亞基特異活性蛋白，分子量為60～64 kDa。螢火蟲熒光素酶報告基因的優點在于只要完成轉錄翻譯，其表達產物就立刻具有可被檢測的酶活[3]。在 ATP、二價鎂離子（Mg2+）、氧氣（O2）等存在的情況下，螢火蟲熒光素酶會催使底物螢火蟲熒光素發生氧化，消耗 ATP 和 O2產生Lucifery1-AMP （adenosine monophosphate，AMP）中間體（見圖1），氧化的熒光素會從激發態回到基態釋放出光子，產生波長540～600 nm 的黃綠色熒光信號，這類熒光信號可以通過發光檢測儀或CCD（Charge-coupled Device）相機來進行檢測或捕獲[13]。但這一生化反應過程比較緩慢，因此在熒光素酶和熒光素底物混合后產生的熒光會迅速衰減[3]，所以在專業化的試劑盒中會通過添加輔酶A（coenzyme A,CoA）來提高螢火蟲熒光素酶的活性，加快該熒光反應的速度，解決熒光衰減的問題，產生連續的熒光信號。除輔酶A外，牛血清蛋白和氨基乙醇等物質也具有相同的作用[14]。

圖1 螢火蟲熒光素酶化學反應[15]

提取自海洋腔腸動物海腎的熒光素酶也是一種可以催化熒光素發生熒光反應的單亞基特異活性蛋白，其分子量為36 kDa。同螢火蟲熒光素酶一樣，該蛋白質在完成轉錄翻譯后即具有催化活性[15]。海腎熒光素酶不依賴ATP 參與酶促反應，在有熒光底物腔腸素（coelenterazine）和O2等反應物質的條件下，海腎熒光素酶即可催化熒光底物腔腸素發生氧化，在反應過程會產生波長為460～540 nm 的藍色熒光信號（見圖2）。和螢火蟲熒光素酶相似，海腎熒光素酶反應產生的熒光信號也會在短時間內迅速衰減。這種報告基因既可以作為內參與螢火蟲熒光素酶等其他報告基因一起組成雙檢測系統，也可以作為一種單獨的檢測系統用于實驗。天然腔腸素在適宜條件下能夠穿越活細胞的細胞膜，與活細胞內表達的海腎熒光素酶發生酶促反應產生熒光，因此海腎熒光素酶報告基因適用于有活細胞檢測需求的實驗[11]。

圖2 海腎熒光素酶化學反應[15]

Promega 公司是最早將螢火蟲熒光素與海洋腔腸熒光素酶兩種不同熒光檢測體系相結合提供雙熒光素報告基因系統的生物制劑公司，該檢測系統是一種含有內參、可歸一化處理實驗數據、分析實驗現象的方案[16]。螢火蟲熒光素酶和海洋腔腸熒光素酶檢測到的是具有不同特征的數據，歸一化處理可以使這些數據變得具有可比性的同時又保留一定的相對關系。即在實驗中可以通過設置合理的內參，讓實驗預處理過程得到的沒有可比性的數據得到一定的限制，能夠對照參照物進行計算，進而消除各種實驗差異如細胞數、轉染效率、細胞狀態、裂解效率、檢測溫度、時間等因素帶來的影響[17]。

早期的雙熒光素酶報告系統需要裂解細胞，并先后完成兩個生物熒光反應的定量檢測，再對實驗數據進行處理和分析，以達到對兩個同時表達的報告基因的表達活性進行檢測的目的[18]。實驗步驟是首先將構建好的、帶有目的基因啟動子的報告基因載體和內參載體共轉染到培養細胞中進行表達，檢測熒光時要用裂解液將轉染的細胞進行破碎裂解，然后加入螢火蟲熒光素與螢火蟲熒光素酶發生熒光反應。隨后，用熒光檢測工具對熒光強度進行測定，檢測完成后還需淬滅該熒光反應，再加入腔腸素與海腎熒光素酶發生熒光反應，檢測其熒光強度[17]。其中螢火蟲熒光素酶作為主報告基因，其表達水平隨外界的處理而發生變化，海腎熒光素酶作為內參報告基因，其表達水平一般不會隨外界處理而發生變化[18]。

目前，Thermo 公司研發了一種比較便捷的雙分泌型螢光素酶報告基因檢測技術，其選用的是Gaussia 分泌型熒光素酶和Cypridina 分泌型熒光素酶[19]。這兩種酶均為分泌蛋白，在表達過程中會通過內質網分泌到細胞外，因此實驗時不需要裂解細胞，取培養液上清就能進行熒光檢測。但是這兩種酶的熒光信號波長相似，一起檢測的話難以分辨，一般要將測試樣品分為相同的兩組再分別用不同的熒光素底物對酶活性進行檢測，借此進行區分。這種檢測技術不用考慮熒光素酶在細胞內底物的影響，比螢火蟲熒光素酶有更高的檢測靈敏度和更廣的動態檢測范圍[20]。

3 雙熒光素酶報告基因系統在家蠶基因啟動子研究中的應用

在1995年，國內就有研究者首先將野生型家蠶BmNPV病毒基因組DNA 與克隆帶有熒光素酶基因的pBmL 質粒進行重組，再將重組后的載體轉染到家蠶細胞中進行表達，獲得載有熒光素酶基因的重組病毒rBmNPVLu。研究發現，該重組病毒帶有的熒光素酶基因能夠在家蠶細胞中進行轉錄表達。隨后，將重組病毒注射進家蠶幼蟲體內，檢測發現與其他病毒基因一樣，熒光素酶基因在家蠶幼蟲和蛹中注射重組病毒后的第5 天左右表達最高[21]。

3.1 相似性基因啟動子活性差異的研究

家蠶有3 個BmSDH（Bombyx mori sorbitol dehydrogenase，BmSDH）基因，即BmSDH-1、BmSDH-2a、BmSDH-2b。其中BmSDH-2a和BmSDH-2b在基因結構和蛋白結構上都具有很高的相似性，二者可能具有相似的生理功能，而BmSDH-1則存在較大差異。于是朱娟等人利用PCR 技術克隆這3 個基因的啟動子，分別構建帶有螢火蟲熒光素酶報告基因的載體，并與pRL-CMV報告質粒（含海腎熒光素酶報告基因）共轉染家蠶BmN 細胞，通過雙熒光素酶檢測系統檢測BmSDH基因啟動子的活性。實驗結果表明，BmSDH-2a的啟動子活性極顯著高于BmSDH-1和BmSDH-2b[22]。謝雨辰等人推測，家蠶卵內山梨醇脫氫酶的活性主要來自BmSDH-2a基因的表達。他們利用滯育激素、保幼激素（juvenile hormone，JH）和蛻皮激素（20 -hydroxyecdysone，20 E）處理轉染有BmSDH-2a基因啟動子（序列長度1082 bp）的熒光素酶報告基因系統的家蠶細胞，發現滯育激素不能調節BmSDH基因的表達，而高濃度的保幼激素和蛻皮激素則會抑制BmSDH基因的表達[22]。

趙斯斯等人發現家蠶細胞色素P450 家族CYP9A19和CYP9A22兩個基因的表達存在組織特異性，CYP9A19在中腸、絲腺、脂肪體、馬氏管中均有較高水平的表達；CYP9A22在中腸、絲腺、馬氏管中有表達，但在脂肪體中無表達。為了研究這兩2 個基因的表達調控機制，其構建了含熒光素酶報告基因和啟動子不同長度順次缺失片段的重組質粒，采用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測啟動子活性。結果表明：家蠶CYP9A19基因起始密碼子游-1492～-1102 bp區域是重要的轉錄活性區域；CYP9A22基因啟動子起始密碼子上游-1630～-1210 bp 這一區域是重要的轉錄活性區域。用不同濃度的氟化鈉誘導細胞后，發現0.1×10-3mol/L的NaF 能使熒光素酶活性增強顯著，即0.1×10-3mol/L NaF能上調這2 個基因的表達[15]。

3.2 基因啟動子序列區域調控元件的研究分析

謝雨辰等通過雙熒光素酶報告基因系統對BmSDH-2a基因啟動子反應元件進行鑒定，結果顯示在BmSDH-2a啟動子序列中-355～-674 bp 和-674～-1082 bp 的兩個區域之間存在負調控元件[23]。莊蘭芳等利用雙熒光素酶報告基因系統對家蠶熱激蛋白hsp70基因5’端的序列：hsp70 -1～hsp70 -305 和hsp70 -1～hsp70 -538 進行比較，結果顯示片段hsp70 -1～hsp70 -538 的表達活性是hsp70 -1～hsp70-305 的1～3 倍，并且hsp70 -1～hsp70 -538 除了包含共有的熱激元件（heat shock element，HSE）外，還包含3 個可能的HSE 元件[24]。

Li 等研究者以家蠶為模型，利用雙熒光素酶報告基因系統證明了20 E 信號傳導的初級應答基因E75不同亞型介導的蛻皮甾類生物合成與20 E 信號傳導之間存在的調節環路。結果顯示，E75基因的亞型A 和C 可以直接與Halloween基因啟動子區域中的視黃酸受體相關反應元件結合，以誘導基因表達，從而促進蛻皮甾類生物合成和發育提前，而亞型 B 通過物理相互作用拮抗亞型A/C 對Halloween基因的轉錄活性。由于20 E 差異誘導E75基因亞型的表達，因此E75基因介導的調節環代表了類固醇生成的良好自動調節，這有助于精確控制發育時機[25]。

細胞自噬的發生需要在多個細胞自噬相關（autophagyrelated, Atg）蛋白的參與下才能完成[26]。Tian 等通過雙熒光素酶報告系統和凝膠遷移等一系列實驗研究發現，20 E 通過其受體EcR/Usp 結合到關鍵自噬基因Atg1的啟動子區域反應元件誘導其表達，從而促進細胞自噬的發生[26]。顧健健等利用雙熒光素酶報告系統在已報道的BmVgP78 M啟動子上游利用基因工程連接了一段BrC-Z2 轉錄因子結合序列（BrC-Z2 element，BrC-Z2E），連接的這段序列可以對20 E進行應答并增強該啟動子活性[27]。

陳恩祥研究發現，家蠶BmVgR（Bombyx mori vitellogenin receptor）基因的啟動子均存在大量的POU 結構域，他們利用熒光素酶報告系統、凝膠阻滯實驗（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）和染色質免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation assay，ChIP）等實驗驗證了家蠶POU 結構域轉錄因子POU-M2 能夠結合到BmVgR啟動子上并啟動BmVgR的高表達。同時，他們還研究發現20 E 能夠誘導BmVgR的轉錄，20 E 信號傳導因子BrC-Z1 能夠結合到POU-M2基因的啟動子區域誘導其表達，進而增強BmVgR的表達[28]。

3.3 研究小RNA 對靶向基因轉錄表達的影響

小RNA 為長度小于200 nt 的非編碼RNA，主要包括微RNA（microRNA，miRNA）、小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）和Piwi-interacting RNA（piRNA）等，在轉錄和轉錄后水平上調控，以發揮基因沉默的作用。

家蠶細胞質多角體病毒（Bombyx moricytoplasmic polyhedrosis virus，BmCPV）感染家蠶后誘導的胰島素相關肽結合蛋白2（Insulin-related peptide-binding protein2，IBP2）基因，可能是小分子RNA miR-278 -3P 的靶標之一。Wu 等構建PmirGLO-IBP2 和PmirGLO-IB2P2-mut（突變型）雙熒光素酶報告基因載體，研究發現PmirGLO-IBP2和miR-278 -3p 模擬物共轉染的細胞中，熒光素酶活性顯著降低；在PmirGLO-IBP2-mut 和miR-278 -3p 模擬物共轉染的細胞中，螢光素酶活性沒有變化。這表明，在BmCPV感染后，可高度誘導B.mori IBP2基因的表達，并且被miR-278 -3p 負調控[29]。

根據家蠶核型多角體病毒（Bombyx morinucleo polyhedrosis virus，BmNPV）感染家蠶后小RNA 表達的變化，姜曉旭預測miR-277 -5p 可靶向作用于家蠶DNA 甲基轉移酶基因Dnmt（DNA methyltransferase），通過構建PmirGLO-Dnmt2和PmirGLO-Dnmt2-mut（突變型）雙熒光素酶報告基因載體等研究發現miR-277 -5p 對Dnmt基因表達具有顯著的抑制作用[30]。

此外，雙熒光素酶基因報告系統也可用于檢測家蠶生長發育過程中小RNA 對基因轉錄表達的調控。劉曉等利用實時熒光定量PCR技術研究發現piR-4682（Piwi-interacting RNA-4682）在家蠶精巢、卵巢和血淋巴中表達量較高。隨后，研究人員還發現在piR-4682 相同的作用位點存在另一個miRNA-305，它們均靶向調控small wing基因，將該基因的CDS（coding sequence）片段構建在psiCHECK 熒光素酶報告基因載體上，得到重組載體psiCHECK [small wing]。piR-4682 和miR-305 的類似物對small wing基因的表達都有一定抑制作用[31]。

陳恩祥等篩選出10 個從卵黃發生期到卵殼形成期上調表達的miRNAs 可能參與調控BmVgR基因的表達。他們將BmVgR3’UTR 構建至psiCHECKTM-2 海腎熒光素酶報告基因載體中，然后用這些miRNA 類似物（mimic）處理發現其中兩個miRNAs 分別使熒光素酶活性降低了33.4%和38.4%，當兩種miRNAs 同時存在時抑制作用更強，說明它們可能通過結合BmVgR3’UTR 上的作用位點來調控BmVgR基因的表達[28]。

4 啟動子活性研究系統的發展與展望

目前而言，啟動子活性的研究還非常依賴報告基因系統技術的發展，而熒光素酶報告基因系統較其他報告基因系統具有更多的優點和可操作性。同時也得益于生物技術和科學的飛快發展，螢火蟲熒光素酶報告基因系統將會擁有更多的提升和進步空間。熒光素酶報告基因在應用過程中有以下幾點優勢：（1）在使用過程中不涉及放射性，使用安全污染；（2）熒光素酶檢測信號強，比CAT（cat reporter assay）等其他報告基因檢測速度更快，靈敏度高將近100～1000 倍[32]；（3）樣品檢測步驟簡單，操作方便；（4）比顯微鏡檢測熒光更靈敏，沒有非特異性激發光干擾，信噪比高不易受底物影響；（5）熒光素酶的半衰期短[33]；（6）檢測濃度線性范圍廣，只要熒光素酶的濃度在10-16mol/L（10pg/L）到10-8mol/L（1mg/L）內均合適檢測[32]。

但雙熒光素酶報告基因在應用過程中也有諸多注意事項，例如：（1）為了良好的測定效果，在雙熒光素酶測試試劑與測試樣品混合到測定的這段時間要保持一致，避免過長地停滯（要在1～2 s 時間內進行測定）；（2）Renilla 熒光素酶檢測液不能長期保留，配制后要立即使用；（3）熒光素底物反應液配制后不能反復凍融，不同批次的配制液可能存在差異；（4）溫度對酶有很大影響，要保證樣品和試劑測定時完全達到室溫[17,20]。不過，當前也有些單個載體（如pmirGLO）能夠同時攜帶兩個不同的熒光素酶報告基因，還有各種功能性載體能滿足不同實驗的需求。

隨著人類對基因啟動子活性研究的逐漸深入，對于實驗工具和研究體系的要求也會進一步提高，啟動子活性研究系統亦會得到進一步的發展。隨著科技的進步，實驗操作和應用技術也將愈加熟練可控，新型技術運用范圍也會更加廣泛?？梢灶A見，人類的智慧的發展和科學技術的飛躍會使雙熒光素酶報告基因系統變得更加便利、高效，從而獲得更廣、更深的發揮空間，直至該項技術被更好的啟動子活性研究系統所取代。