研究微生物細胞傳感器在環境監測中的應用進展

■黃勇剛

（四川省眉山市東坡區環境監測站　四川　眉山　620000）

研究微生物細胞傳感器在環境監測中的應用進展

■黃勇剛

（四川省眉山市東坡區環境監測站四川眉山620000）

針對微生物細胞傳感器在環境監測中的應用進行分析，總結了調節基因、啟動子部分的應用進展，報告基因部分的應用進展等，認為在微生物細胞傳感器中，最為重要的內容便可以感應污染物質的啟動子以及對調節基因系統。同時解釋了lux主要由A、B、C、D、E幾個部分組成。此外，還討論了對報告基因表達機制的調控，報告菌株的固定化和生物芯片技術以及微生物細胞傳感器研究的展望等內容，以期為生物細胞傳感器在環境監測中的應用提供一定的理論依據。

微生物細胞傳感器環境監測基因系統

微生物細胞傳感器主要指的是通過一定的時間以及一些固定化方法對毒性環境或者特定污染物具有一定的感應能力，將微生物菌株以及存在信號轉換功能的介質相互連接，并借此設備經信號放大并輸出。這種裝置可以對環境中的毒效應起到一定的感應作用，但是當下新發展的特異性微生物細胞傳感器已經可以對某一類別的污染物質進行檢測。

1　調節基因、啟動子部分的應用進展

在微生物細胞傳感器中，最為重要的內容便可以感應污染物質的啟動子以及對調節基因系統。根據全細胞系統構建過程中所遵循的目標有所不同，選用啟動系統也存在著較大的差異[1]。非特異性的生物傳感器具備的啟動子是通過組成型進行表達的。不管在何種情況下，都會對其后的基因進行啟動，進而產生信號。但是對于半特異性傳感器而言，因為其可以對一些較為特殊的脅迫產生一定的感應，因此對啟動子系統進行選用也是對這種類型壓力一級脅迫具備一定感應能力的。例如SOS反映中的recA、熱激反映中具備的rpoH啟動子。特異性傳感器可以對一些化學污染物起到一些報告作用，因此這種類型的傳感器存在的調節基因、啟動子系統類型較多，但仍舊存在著共同選擇的原則。

2　報告基因部分的應用進展

報告基因是檢測目的基因的一種表達手段，并被廣泛的使用在分子生物學的研究中。在一個特定的條件下，可以對報告基因進行啟動表達，對蛋白進行編碼和報告，這種類型的蛋白產生一定的光信號或者相應的顏色反映，能夠在不對菌體生長情況帶來影響的情況下被靈敏檢測出來，這就為原位和在線檢測提供了有力條件。報告基因基本上被分為以下幾個特點：（1）對報告基因進行表達的活性定量方式一定要簡單。（2）報告的蛋白量以及活性一定要通過目標分析物的質量進行反應。（3）在細胞體內部，存在少量或者沒有和蛋白作為同源性的相似蛋白或酶。當下，微生物細胞傳感器方面存在的報告基因主要有luxCDABE、lacZ、gfp等。

通常情況下，不同類型的發光菌中存在著徐細菌熒光素酶基因lux，當前，人們已經從哈氏弧菌、明亮發光桿菌以及費氏弧菌等大量發光菌中克隆出這種類型的基因。這種基因可以被分為A、B、C、D、E幾個部分，這五種組成部分中的AB屬于編碼兩條多肽鏈組合而成的熒光素酶，而CDE分別是編碼還原酶、轉移酶以及合成酶。這三種酶相互聚合，形成了一種酶復合物[2]。FMNH2，也就是細菌熒光素催化還原性黃素單核苷酸，以及FMN，即長鏈脂肪醛屬于黃素單核苷酸產生如下反映：

在這種反應中，可能會產生一定的藍色光或者綠色光，Lux具有較高的蛋白靈敏度，不必再添加底物，在普通的額菌株中不存在內源活性，但它也存在著一定的缺點。例如在對定時線性進行測定的過程中，其范圍比較窄，這就導致其熱穩定性不高。

近幾年，相關研究者從多管水母屬的Aequorea victoria中將天然熒光蛋白GFP進行分離，其也在生物傳感器的報告系統中被廣泛應用。GFP在進行報告蛋白的過程中存在的最大的優勢就是其自身具備的熒光，這種方式并不需要格外加上底物。與此同時，GFP屬于較為穩定的蛋白質，在這之中產生的一些變種可能會達到24h。但是對于一些較為普通的蛋白，通常情況下僅僅是40min，即便在較弱的啟動子條件下，或者其生理代謝條件不是很強的條件下，GFP同樣可以在細胞中生長很長時間。因此可以將GFP在實時、連續的監測中使用。而且進行GFP熒光信號進行監測是比較簡單的，不必再添加相應的底物，只需要對其采用395nm或者488nm波長的燈進行照射便可[3]。GFP可以在異源細胞中穩定的將熒光進行表達和發射，在此過程中不必增加輔助因子，對于細胞來說也沒有任何毒性，對其進行檢測十分方便。因此，GFP這種標記基因，已經成為對環境微生物進行研究的這一過程中比較方便而有效的工具，但這種蛋白也存在著一定的缺點。例如，這種方式具備的敏感性不是很高，需要對其進行翻譯并修飾，只有這樣才能發出熒光。因此，對宿主細胞提出了一定的要求。在一些生物系統中可能會存在著背景干擾，并且對一些類型的細胞會產生一定的毒害作用。

大腸桿菌中的編碼β-半乳糖苷酶中的lacZ在報告基因系統中應用最早的一種，同時也是當前應用比較廣泛的基因，也就是β-Galactosidase。β-Galactosidase可以在β-半乳糖苷在水解過程中產生一定的催化作用，也正是其具備這一特性，所以可以快速的將其檢測出來[4]。對這種酶進行檢測的過程中，方法眾多，例如比色法、電化學法、組織化學法等。這一報告蛋白具有較好的靈敏度和穩定性，并且存在著比較寬的線性范圍。其中最重要的一點是當期處于厭氧調價下，還可以進行lacZ基因進行表達，但是其具備的條件一般是報告基因中缺乏的條件。這種基因的缺點主要是，在大多數細胞中均存在著內源活性，這就導致背景值提高。而在實際檢測過程中，需要格外添加底物。

3　對報告基因表達機制的調控

通常情況下，將調節基因和啟動子系統報告基因表達機劃分為兩種形式。第一種是可可以進行誘導的負控模式，所調節的基因主要是一個編碼阻遏蛋白的基因，可以經這種蛋白和啟動子相互結合。進而使RNA聚合酶以及這一位點的結合被阻止，從而致使相關人員不能對后面的基因進行轉錄和翻譯。當環境中有目標物質出現時，目標物質會對足額單位構像進行誘導，使其發生改變，并從啟動子位點分離出去。在這個時候，RNA聚合酶就會向上聚合，開始對后面存在的報告基因進行轉錄和翻譯，進而產生相應的信號。第二種機制使一種可誘導正控制，對基因編碼進行調節，并激活蛋白。但如果沒有目標化學物質，這種蛋白的單體就無法和啟動序列之間相互結合，進而導致轉錄翻譯過程不能完成。如果環境中有可以和激活蛋白相結合的目標化學物質時，這種蛋白便會產生一定的構像變化，這時就會使啟動子位點結合并激活，當RNA聚合酶之間結合的時候，報告基因轉錄翻譯完成。

4　報告菌株的固定化和生物芯片技術

4.1報告菌株的固定

通常情況下，對報告菌株進行報告和篩選會在實驗室內獲得較好的檢測結果，這時會碰到較多的束縛條件。因此，要利用一些介質，將報告菌株進行固定，使其在一個特定的材料上，通過這樣的方式可以讓菌株的活性被保持，并且可以將原來的一些信號進行適當的轉換并且放大，通過這樣的方式可以進一步將其制作成芯片，為檢測信號的獲得奠定一定的基礎。

4.2生物芯片技術

生物芯片技術屬于上個世紀90年代發展的新興技術并結合微加工技術而構成的，可以通過很多方式對對中生物樣品進行處理。與此同時，可以將其包含的不同生物信息適當的解析，通過這樣的方式實現分析和檢測的目的。生物芯片技術中主要涉及了生物、化學、光學等內容[5]。對生物傳感器技術進行使用的最終目的是進行生物感應原件和一些信號生產、轉換等過程進行整合，將其放入到芯片中去。通過這樣的方式，可以使其的實際使用性能得到有效提升。

5　生物細胞

因為微生物細胞傳感器在運行過程中速度較快，并且可以進行在線連續監測，因此在現代環境分析和檢測中較為合適?？梢?，在不遠的將來，這一技術將被廣泛的應用在環境檢測領域，并且在這一領域內大放異彩。但當下，仍舊存在著較多的因素對這一技術起著限制作用。因此，在今后的研制工作中，也會圍繞著這一內容進行分析。

5.1實際檢測過程中的相應時間

它是對導入微生物細胞的啟動子進行研究，它主要對倒入微生物強啟動子對污染物帶來影響的進行研究，同時也是檢測過程中的關鍵內容，這種檢測直接對傳感器的靈敏度和精確性，也對相應時間進行控制。為了對這以難點進行更進一步的了解，還需要對細菌基因的表達調控網絡方面的知識進行更深的研究。對這一問題進行研究的過程中，需要將微生物轉錄分析以及后基因組學的相關信息進行適當的結合，通過這樣的方式，將會使找到不同污染物變得更加有效。此外，在發展過程中，出現了大量不同新的污染物，污染物的數量也逐漸增多，這就需要找到跟對不同污染物產生相應的調控原件，這樣就能使不同的環境條得到適應。

5.2信號轉換和便攜式傳感器的研制

對信號轉換器和便攜式傳感器進行研制，當前這種技術發展的關鍵內容。因為，在實際檢測過程中，需要能夠原位、快速并精準，所以需要獲得相對靈敏的轉換介質，從而精準并快速的將可測量信號進行轉化和放大[7]。與此同時，為了使其更加方便的在實際環境的監測中應用，需要對將這一技術作為核心的一些傳感設備和儀器進行研制，這就需要對相應生物傳感器報告菌株進行固定，使其在生物芯片當中。這樣，可以將信息的感應、轉換、集成以及檢測均放在一個芯片上，從而可以迅速的完成。

5.3傳感器細胞生物穩定性和一致性的問題

因為對這種傳感器進行使用的過程中，生物活體是一種敏感元件，因此將其在實際毒性環境檢測中應用時，需要氣具備一定的穩定性和長期性。當前，業內已經存在一些文章和微生物菌體活性保持相關的文章，如相關學者對如何利用冷凍干燥、真空干燥以及繼代培養等固定技術等方式對菌體的活性進行保持的方法。

5.4假陰性問題的研究

假陰性現象的存在會產生錯誤結果，因為在細胞生長過程中，會有諸多因素對其產生影響，例如營養狀況、溫度或者含氧量等。但伴隨著污染物組分的逐漸發展，其會變得越來越復雜，毒物的濃度也會逐漸升高，這種情況下，容易導致細胞活力喪失而死亡，這時將檢測不到信號，導致測量結果出現偏差，從而出現假陰性結果。為了方式這一錯誤結果的發生，當前較為常見的方式為：第一種，對細胞數量進行科學利用，對其生長環境中的總體毒性做出指示，但是針對報告基因的表達信號來說，經特定的毒物或者遭到的脅迫進行指示。第二種方式就是對雙報告基因系統進行科學利用，可以將一些在細胞內處于恒量低水平表達的基因導入，例如racA，并且可以將這種基因具備的變大情況動作是其基線系統對目標毒物做出指示，或者對壓力進行脅迫。

6　結束語

當前，微生物傳感器已經得到了廣泛的應用，在未來的發展過程中也會為環境質量檢測做出巨大的貢獻。相關人員需要做的就是其技術進行不斷的創新和完善，對這一技術進行發展，從而使我們預期的目標得以實現，這樣有望使我國環境問題得到緩解。

[1]趙雨杰,鐘連聲,何群,梁彬,王紹成,潘忠誠,王天驕.生物芯片在微生物學研究中的應用[J].微生物學雜志,2016,01:1-5.

[2]錢俊.基于電化學的微生物傳感器對水體急性生物毒性的檢測分析 [D].吉首大學, 2013.

[3]張宏偉,鄭雅文,王捷,郭幸斐.微生物燃料電池生物傳感器在環境監測中的應用及其研究進展 [J].天津工業大學學報,2015,01:44-49.

[4]唐楠.微生物傳感器的研究現狀及在水環境監測中的應用 [J].四川環境,2011,01:40-44.

The microbial cells sensors in environmental monitoring analysis,summed up the gene,application progress promoter portion is adjusted,to report on progress applications such as part of a gene that in a microbial cell sensor,the most important content can be induced pollution promoter substances and regulating gene system.Meanwhile lux explained mainly by the A,B,C,D,E of several parts.It also discusses the reporter gene expression mechanism of regulation of the reporter strain immobilization and biotechnology as well as prospects Sensor microbial cell chip,etc.,in order to provide a theoretical basis for the biological cell sensor applications in environmental monitoring.

microbial cell sensor;environmental monitoring;gene system

X8[文獻碼]B

1000-405X（2016）-9-357-2