黃酮與溶菌酶相互作用的強度衰減—基質輔助激光解吸離子化—質譜研究

唐君+付強+崔勐+邢俊鵬+劉志強+劉淑瑩

摘要 建立了黃酮與溶菌酶相互作用研究的強度衰減-基質輔助激光解吸離子化-質譜（Intensity fading matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry，IF-MALDI-MS）分析方法。在優化的基質DHB條件下，分別研究了木犀草素、染料木素、芹菜素、槲皮素和大豆黃素與溶菌酶相互作用，比較了溶菌酶加入前后黃酮的相對豐度的變化，并通過競爭實驗的方法研究了5種黃酮與溶菌酶結合的親和性大小。結果表明，5種黃酮與溶菌酶均存在相互作用，親和性強弱為：木犀草素>芹菜素，染料木素>槲皮素>大豆黃素。結合5種黃酮的結構特征，討論了黃酮的結構及其與溶菌酶親和性的關系，發現C5位和C3′位的羥基有利于黃酮與溶菌酶的結合，C3位的羥基不利于黃酮與溶菌酶的結合。本方法具有簡便，快速，高效等優點，也可以應用于其它天然產物與蛋白質的相互作用的研究。

關鍵詞 黃酮； 溶菌酶； 相互作用； 基質輔助激光解吸離子化-質譜

2016-01-29收稿；2016-03-11接受

本文系吉林省科技發展計劃項目（No. 201105032）資助

E-mail： cuimeng@ciac.ac.cn

1 引 言

黃酮是一類重要的天然產物，廣泛存在于各種植物及植物制品中。很多研究報道了它們具有抗炎、抗氧化、抗過敏、抗血栓、抗菌和抗癌等生理活性[1～3]。而黃酮的諸多生理活性主要通過與體內的各種酶、受體、載體的結合而發揮作用[4～6]。溶菌酶是人體內的一種非特異性免疫蛋白，廣泛存在于體液和血清中[7～10]。研究發現溶菌酶可以作為藥物的載體，協助藥物在體內的吸收和轉運[11～13]。所以研究溶菌酶和黃酮的相互作用，不僅有助于了解黃酮的生理活性，更有助于了解黃酮在體內的吸收及代謝情況。

目前， 研究溶菌酶與黃酮相互作用的方法主要有紫外可見光譜、紅外光譜、圓二色譜和熒光光譜等方法[14～17]。但是這些方法的靈敏度和分析通量等尚有不足。隨著現代質譜的發展，質譜以其快速、靈敏、準確等特點在蛋白質與小分子配體研究中起著越來越重要的作用。但是有關黃酮與蛋白質相互作用的研究多局限于電噴霧質譜的方法，例如Chen等曾用電噴霧質譜研究了磷酰衍生化后的黃酮與溶菌酶的相互作用 [18，19]。2003年，Villanueva等[20]首次建立了蛋白質與小分子配體相互作用的強度衰減-基質輔助激光能吸電離-質譜研究方法，該方法主要是基于加入靶蛋白后，小分子配體的離子峰強度發生衰減以識別配體與蛋白質的相互作用。目前該方法已應用到蛋白質和小肽[21]或生物堿相互作用[22]以及配體篩選 [23]的研究中，而對于溶菌酶和黃酮相互作用的研究尚未見報道。本研究建立了黃酮和溶菌酶相互作用的強度衰減-基質輔助激光解吸離子化-質譜（IF-MALDI-MS）方法，不僅快速識別出與溶菌酶相互作用的黃酮化合物，還比較了不同的黃酮與溶菌酶的結合強弱。與電噴霧質譜方法相比，本方法不僅具有傳統MALDI質譜方法的耐鹽、分析速度快等優點，而且還能克服傳統MALDI質譜分析中黃酮與溶菌酶復合物易解離等缺點。本方法不僅為研究其它天然產物與蛋白質的相互作用提供方法學參考，還可應用于與蛋白質相互作用的靶分子的快速篩選。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

MALDI-TOF MS：配有337 nm 脈沖N2激光的Voyager DE-STR儀器 （Applied Biosystems， Framingham， MA）。

溶菌酶（Sigma-Aldrich公司），使用前未做進一步的純化。黃酮：木犀草素、染料木素、芹菜素、槲皮素、和大豆黃素（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）， 5種黃酮的結構如表1所示。 三氮乙酰葡糖胺Tri-N-acetylglucosamine （NAG3，純度≥98%，加拿大Toronto Research Chemicals公司）； 醋酸銨（分析純）、棉籽糖（Fluka公司）； 甲醇（HPLC級，Fisher Chemical公司）； MALDI基質：2，5-Dihydroxybenzoic acid （DHB）、Sinapinic acid （SA）、α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid （CHCA）、2，4，6-Trihydroxyacetophenone （THAP）、2，5-Dihydroxyacetophenone （DHAP）、Hyaluronan （HA）、3-Aminoquinoline （AQ）、3-Hydroxy picolinic acid （HPA）均購于Sigma Aldrich公司； 乙腈（色譜純，Fisher公司）。超純水（18.2 MΩ cm）由 MilliQ 設備（Millipore公司）制得。

2.2 樣品制備

溶菌酶、NAG3和棉籽糖分別用Milli-Q水制備成1 mmol/L的儲備液。黃酮：木犀草素，染料木素，芹菜素，槲皮素和大豆黃素分別用甲醇溶解，并用Milli-Q水稀釋制成1 mmol/L的儲備液。MALDI基質DHB、CHCA、DHAP、THAP、HPA、AQ、SA分別用乙腈-水（1∶1， V/V）配制成濃度為10 mg/mL的溶液。樣品采用干滴法點樣?；|低質量區干擾實驗中，取1 L基質溶液點靶，室溫干燥后進行MALDI-MS分析。模型體系的IF-MALDI-MS實驗中，將NAG3、棉籽糖和水/溶菌酶以 3∶3∶1（V/V）混合制備成為待測溶液，在37℃條件下溫浴5 min。將待測液與基質溶液等體積混合，取1 L混合液點靶，室溫干燥后進行MALDI-MS分析。黃酮與溶菌酶的IF-MALDI-MS實驗中，將黃酮，棉籽糖和水/溶菌酶以 3∶3∶1（V/V）混合制備成為待測溶液，在37℃下溫浴5 min。將待測液與基質溶液等體積混合，取1 L混合液點靶，室溫干燥后進行MALDI-MS分析。競爭實驗是將黃酮A、黃酮B、棉籽糖、水/溶菌酶以1.5∶1.5∶3∶1（V/V）混合，在37℃下反應5 min后，將待測液和等體積的DHB溶液混合，取1 L混合液點靶，室溫干燥后進行MALDI-MS分析，每個樣品測定3次，取平均值。

2.3 質譜條件

采用正離子反射模式：激光源為337 nm的N2源，質量掃描范圍m/z 200～1500，加速電壓設置為22 kV，延長時間設置為100 ns，每張譜圖均通過100次激光輻照累加平均得到。

3 結果與討論

3.1 MALDI基質優化

由于5種黃酮（木犀草素、芹菜素、槲皮素、染料木素和大豆黃素）的分子量均在200～400 之間（表1），選擇在低質荷比區域（m/z 200～400）干擾較小的基質非常重要，因而對7種基質DHB、CHCA、DHAP、THAP、HPA、AQ和SA在低質荷比區域的出峰情況進行了MALDI-MS研究。實驗結果如表2所示，對黃酮的MALDI-MS檢測的影響較小，用“-”表示；而在低質荷比區域出峰較多，對黃酮的檢測干擾較大的基質用“+”表示。結果表明，3種基質DHB、THAP和SA在低質荷比區域出峰較少。

3.2 模型體系的IF-MALDI-MS實驗

利用3種在低質荷比區域干擾較小的基質（DHB、THAP、SA）對模型體系進行了IF-MALDI-MS實驗。選擇溶菌酶和與其特異性結合的NAG3[24]和內標棉籽糖為模型體系，分別對混合溶液進行MALDI-MS檢測，比較了在加入溶菌酶前后NAG3與內標峰強度比的變化。由表2可知，只有當DHB作基質時，NAG3與內標峰強度比降低明顯（數據未給出），用”+”表示。THAP和SA作基質時，未觀察到模型體系的強度減弱現象，用“-”表示，因此，本實驗中選擇DHB作為基質。

3.3 溶菌酶與黃酮的IF-MALDI-MS實驗

將5種黃酮分別與棉籽糖混合制備成為待測溶液，對待測溶液加入溶菌酶前后的混合液進行IF-MALDI-MS實驗，結果如圖1所示。其中，左欄為加入溶菌酶之前的混合液的MALDI的質譜圖，右欄為加入溶菌酶之后的混合液的MALDI質譜圖。從圖1可見，加入溶菌酶后，5種黃酮與內標的峰強度比均減弱，說明這5種黃酮與溶菌酶均存在相互作用。圖1b中離子峰m/z 481.7為基質DHB的加合離子峰[（DHB）3+H2O+H]+。由圖1還可見，加入溶菌酶樣品后，內標的[M+Na]+離子峰較[M+K]+有顯著升高， 這很可能是由于溶菌酶樣品在制備過程中會有少量的Na+引入，以及Na+與小寡糖分子的結合力要高于K+導致的[25]。

3.4 競爭實驗

為了研究5種黃酮與溶菌酶的親和性大小，采用競爭實驗的方法，首先將黃酮A、黃酮B以及內標（IS）按一定比例混合成為待測液，對待測液加入溶菌酶前后的混合液進行MALDI-MS測定。比較加入溶菌酶前后的黃酮A和黃酮B相對于內標的離子峰強度比的變化（ΔRI（A）和ΔRI（B）），以下是計算公式：

其中，I（A）o， I（B）o和I（IS）o分別表示的是加入溶菌酶前的MALDI質譜圖中黃酮A，黃酮B和內標IS的相對豐度。I（A），I（B） 和I（IS）分別表示加入溶菌酶后的MALDI質譜圖中黃酮A，黃酮B和內標IS的相對豐度，其中內標的相對豐度均為[M+Na]+峰和[M+K]+峰的相對豐度的總和。以染料木素和木犀草素的競爭實驗為例，圖2a表示的是加入溶菌酶前的染料木素（MA）、木犀草素（MB）和內標（IS）的MALDI質譜圖，圖2b表示加入溶菌酶之后的染料木素（MA）、木犀草素（MB）和內標（IS）的MALDI質譜圖。經過計算發現，ΔRI（木犀草素）>ΔRI（染料木素），說明木犀草素與溶菌酶的結合親和性比染料木素更強。

其它黃酮的競爭實驗的分析結果如表3所示。5種黃酮與溶菌酶結合親和性順序為：木犀草素>芹菜素，染料木素>槲皮素>大豆黃素。由于芹菜素和染料木素的分子量相同，所以沒有對兩者與溶菌酶的親和性強弱進行比較。采用IF-MALDI-MS方法所得到的黃酮與溶菌酶的親和性大小與熒光結果是一致的[26]，進一步證實了本方法的可靠性。

3.5 黃酮結構和黃酮與溶菌酶親和性關系的研究

Yang 等[26]采用熒光光譜方法發現，黃酮與溶菌酶結合的親和性與黃酮的羥基的位置和數量有關。本研究結果表明：（1）黃酮苷元C3位的羥基不利于黃酮與溶菌酶的結合。槲皮素比木犀草素在C3位多一個羥基，其與溶菌酶的親和性小于木犀草素。（2）黃酮苷元的C3′位的羥基有利于黃酮與溶菌酶的結合。木犀草素比芹菜素在B環的C3′位多一個羥基，其與溶菌酶的親和性大于芹菜素。（3）黃酮苷元的C5位的羥基有利于黃酮與溶菌酶的結合。染料木素比大豆黃素在A環的C5位多一個羥基，其與溶菌酶的親和性大于大豆黃素。

References

1 Mamadalieva N Z， Herrmann F， El-Readi M Z， Tahrani A， Hamoud R， Egamberdieva D R， Azimova S S，Wink M. J. Pharm. Pharmacol.， 2011，

63（10）： 1346-1357

2 Luo Y， Li X， He J， Su J， Peng L， Wu X， Du R， Zhao Q. Food Chem.， 2014， 164： 30-35

3 Hoensch H， Oertel R. Dtsch. Med. Wochenschr.， 2012， 137（51-52）： 2738-2740

4 Middleton E， Kandaswami C， Theoharides T C. Pharmacol. Revi.， 2000， 52（4）： 673-751

5 Dangles O， Dufour C. Flavonoids： Chem. Biochem. Appl.， 2006： 443-469

6 Havsteen B H. Pharmacol. Ther.， 2002， 96（2）： 67-202

7 Cohn Z A， Hirsch J G. J. Exp. Med.， 1960， 112（6）： 983-1004

8 Greenwald R A， Josephso A S， Diamond H S， Tsang A. J. Clin. Invest.， 1972， 51（9）： 2264-2270

9 Pinkus G S， Said J W. Am. J. Pathol.， 1977， 89（2）： 351-366

10 Jash C， Kumar G S. RSC Adv.， 2014， 4（24）： 12514-12525

11 Paramaguru G， Kathiravan A， Selvaraj S， Venuvanalingam P， Renganathan R. J. Hazard. Mater.， 2010， 175（1-3）： 985-991

12 Ding F， Zhao G， Huang J， Sun Y， Zhang L. Eur. J. Med. Chem.， 2009， 44（10）： 4083-4089

13 Ding F， Li X N， Diao J X， Sun Y， Zhang L， Ma， L， Yang， X L， Zhang L， Sun Y. Ecotox. Environ. Safe.， 2012， 78： 41-49

14 Roy A S， Utreja J， Badhei S. J. Incl. Phenom. Macrocycl. Chem.， 2015， 81（3-4）： 385-394

15 Cheng L L， Wang M， Wu M H， Yao S D， Jiao Z， Wang S L. Spectrochim Acta A， 2012， 97： 209-214

16 Huang Y， Cui L J， Wang J M， Huo K， Chen C， Zhan W H， Dou Y H. Eur. J. Med. Chem.， 2011， 46（12）： 6039-6045

17 CHEN Lin， HUANG Ping， YANG Hui-Qing， DENG Ya-Bin， LI Dong-Hui. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（7）： 962-967

陳 林， 黃 萍， 楊惠卿， 鄧雅斌， 李東輝. 分析化學， 2014， 42（7）： 962-967

18 Chen X L， Qu L B， Zhang T， Liu H X， Yu F， Yu Y Z， Liao X C， Zhao Y F. Anal. Chem.， 2004， 76（1）： 211-217

19 Chen X L， Liu H X， Qu L B， Yu Y Z， Lu J S， Zhao Y F. Anal. Chim. Acta， 2004， 511（1）： 175-182

20 Villanueva J， Yanes ， Querol E， Serrano L， Aviles F X. Anal. Chem.， 2003， 75（14）： 3385-3395

21 Wang Z， Yu X， Cui M， Liu Z， Song F， Liu S. J. Am. Soc. Mass Spectrom.， 2009， 20（4）： 576-583

22 Liu W， Liu S， Li H， Song F， Liu Z， Liu S. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2011， 25（7）： 973-978

23 Yanes ， Villanueva J， Querol E， Aviles F X. Drug Discovery Today Targets， 2004， 3（2）： 23-30

24 Von Dreele R B. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr.， 2005， 61： 22-32

25 Cancilla M T， Penn S G， Carroll J A， Lebrilla C B. J. Am. Chem. Soc.， 1996， 118（28）： 6736-6745

26 Yang R， Yu L， Zeng H， Liang R， Chen X， Qu L. J. Fluoresc.， 2012， 22（6）： 1449-1459

Abstract Flavonoids are reported to have a variety of biological activities. Investigations on the interactions of flavonoids with protein are essential to understand the biological activities of flavnoids. In this paper， by using the optimized matrix 2，5-dihydroxybenzoic acid （DHB）， we investigated the interaction of five flavonoids （luteolin， apigenin， genisten， quercetin， dazein） with lyszoyme using intensity fading （IF）-MALDI-MS method. The changes of relative abundances of flavonoids before and after addition of lyszoyme were calculated， and the binding affinity order was obtained by competitive experiments. It was found that all of the five flavonoids bound specifically to lysozyme. And the order of binding affinities of the five flavonoids to the lysozyme was luteolin>apigenin， genisten>quercetin>dazein. Based on their structures， it was found that the hydroxyl on C5 and C3′ benefited the binding of flavonoid towards lyszoyme. However， the hydroxyl on C3 hindered the binding of flavonoid towards lysozyme. The results should be helpful to understand the biological activity of flavonoids. And the IF-MALDI-MS method could also be used to screening the interactions of other natural products and protein.

Keywords Flavonoid； Lysozyme； Interaction； Matrix-assisted laser desorption/ionization； Mass Spectrometry