清腸化濕方對潰瘍性結腸炎患者外周血T淋巴細胞亞群的影響

趙 崧， 陸玥琳， 馮 皖， 沈 洪

(江蘇省中醫院消化科， 江蘇 南京 210029)

清腸化濕方對潰瘍性結腸炎患者外周血T淋巴細胞亞群的影響

趙 崧， 陸玥琳， 馮 皖， 沈 洪

(江蘇省中醫院消化科， 江蘇 南京 210029)

目的:探討中藥清腸化濕方對潰瘍性結腸炎患者外周血T淋巴細胞亞群的影響。方法:收集江蘇省中醫院門診及住院治療的21例濕熱內蘊證輕型潰瘍性結腸炎患者，采用中藥清腸化濕方口服加灌腸治療，療程3個月。觀察單用中藥的療效，應用特異性細胞固定及檢測法比較治療前后患者外周血T淋巴細胞亞群的變化，以配對t檢驗進行統計分析。結果:清腸化濕方治療后與治療前比較患者外周血CD3＋及CD4＋細胞數差異無統計學意義(P＞0.05)；CD8＋細胞數治療后與治療前相比降低，差異具有統計學意義(P＜0.05)；CD4＋/CD8＋比值治療后與治療前相比升高，差異具有統計學意義(P＜0. 05)。結論:中藥清腸化濕方對潰瘍性結腸炎患者外周血T淋巴細胞亞群具有調節作用，通過調整機體免疫反應抑制腸道炎癥。

清腸化濕方； 潰瘍性結腸炎； T淋巴細胞亞群

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種以結直腸的慢性復發性炎癥為特征的疾病，中醫學認為UC活動期的病機較多存在大腸濕熱，該證型的主要治法為清化腸道濕熱。清腸化濕方是本院沈洪教授以芍藥湯為主方，并且結合多年用藥經驗及單味中藥篩選實驗逐步優化而來的驗方，在臨床中已取得較好的療效，并在前期研究中證實能夠抑制UC患者Th17細胞的生成與活化[1]。本實驗擬通過UC患者外周血T細胞亞群的分析，探討清腸化濕方對UC患者免疫反應的影響。

1　資料與方法

1.1診斷標準及中醫辨證分型標準:UC診斷參照《炎癥性腸病診斷與治療共識意見》[2]。中醫辨證分型參照《潰瘍性結腸炎中醫診療共識意見》[3]。

1.2納入標準:符合UC臨床診斷標準；且中醫辨證屬濕熱內蘊證；年齡18～65歲。排除以下情況:感染性結腸炎包括細菌性痢疾、阿米巴痢疾、慢性血吸蟲病、腸結核等；克羅恩病、缺血性腸炎、放射性腸炎患者；有嚴重并發癥如局部狹窄、腸梗阻、腸穿孔、中毒性結腸擴張、大出血、結直腸癌患者；具有其他原發性、繼發性感染性疾病患者。

1.3一般資料:臨床病例為2015年1月至2015年9月江蘇省中醫院脾胃病科門診及住院的41例UC活動期患者，男20例，女21例，年齡20～60歲(中位年齡40.5歲)，病程0.5～6.0年。按Baron分級標準評定內鏡下黏膜表現[4]，組織學分級由本院2位病理科醫生閱片評定。41例UC活動期患者中選擇屬于輕度且中醫辨證屬濕熱內蘊證者21例，年齡24～59歲(中位年齡42.6歲)，病程0.5～6.0年。21例患者納入研究前的3個月內均未使用過美沙拉嗪及糖皮質激素。本研究所涉及的倫理問題經江蘇省中醫院倫理委員會審核通過，并且所得外周血樣品得到患者的知情同意。

1.4治療方法:清腸化濕方，藥物組成:黃連6g，黃芩10g，白頭翁10g，煨木香10g，炒白芍20g，炒當歸10g，肉桂3g(后下)，生甘草6g。水煎服，每天1劑，臨床可根據病情變化隨證加減；配合灌腸方(黃柏30g，石菖蒲20g，苦參10g，地榆30g，白及9g，三七粉3g，訶子10g，錫類散1.5g)，濃煎至120mL，每晚睡前灌腸1次，連續灌腸12d后停灌2d，中藥飲片由江蘇省中醫院藥房提供；錫類散為南通精華制藥股份有限公司生產，每支1.5g，批號:51160101。療程為3個月。

1.5檢測指標及方法:療效判定:①完全緩解:患者臨床癥狀、體征完全消失，內鏡下表現腸道黏膜無異常；②有效:臨床癥狀、體征基本消失，內鏡下表現可見腸道黏膜輕微的炎性改變；③無效:患者臨床癥狀、體征無改善，甚至加重?？傆行剩?完全緩解例數＋有效例數)/總例數×100%。治療前后患者外周血T淋巴細胞亞群分析:采用上海匯中細胞生物科技有限公司SemiBio CD系列(CD3/4/8)細胞檢測玻片分析。取患者靜脈血標本，吸取20μL搖勻，EDTA抗凝全血加入380μL磷酸鹽緩沖液中，即刻混勻。將濕盒置于水平工作臺，加入室溫水直至濕盒底部被完全覆蓋。取出玻片，吸取5μL稀釋血樣，滴入玻片方框區域中央。蓋緊盒蓋，室溫孵育40min，將玻片按序插入玻片架，放入磷酸鹽緩沖液中，直至玻片呈無色透明。即刻放入過氧化酶染色液中，靜置1min。將略干燥后的玻片架放入新鮮的過氧化氫溶液中，靜置4min。再將玻片架轉入75%乙醇中清洗至干凈。將玻片置于SemiBio自動玻片干燥儀下干燥6min，放入復染液中，靜置1min。轉入純水中，靜置30s，吹干。通過SemiBio全自動可視化細胞檢測儀進行細胞自動計數、分析。該檢測方法正常參考值:CD3＋細胞絕對計數770～2860個/μL，CD4＋細胞絕對計數414～1440個/μL，CD8＋細胞絕對計數238～1250個/μL，CD4＋/CD8＋比值0.7～2.87。

1.6統計學方法:應用SPSS19.0統計軟件，計量資料以±s表示，治療前后各指標比較采用配對t檢驗，統計作圖采用GraphPad Prism 6。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結 果

圖1　治療前后CD3＋細胞比較

圖2　治療前后CD4＋細胞比較

圖3　治療前后CD8＋細胞比較

圖4　治療前后CD4＋/CD8＋比較

2.1臨床療效觀察:21例患者其中有1例患者實驗期間加用美沙拉嗪治療，判定為病例脫落。20例患者單純使用清腸化濕方治療，其中12例完全緩解，6例有效，2例無效?？傆行蔬_90%。

2.2患者治療前后外周血T淋巴細胞亞群比較?；颊咧委熀笈c治療前比較外周血CD3＋及CD4＋細胞數差異無統計學意義(P＞0.05)；CD8＋細胞數治療后與治療前相比降低，差異具有統計學意義(P＜0.05)；CD4＋/CD8＋比值治療后與治療前相比升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)。(見表1及圖1～4)

表1　患者治療前后外周血T淋巴細胞亞群比較(±s)

表1　患者治療前后外周血T淋巴細胞亞群比較(±s)

時間CD3＋(個/μL)CD4＋(個/μL)CD8＋(個/μL)CD4＋/CD8＋治療前1381.50±292.15 711.45±153.29 593.95±119.44 1.21±0.19治療后1376.90±268.27 718.10±164.34 511.50±102.69 1.41±0.23 t0.18760.36455.2136.012 P0.85310.7195＜0.001＜0.001

3　討 論

本試驗中患者外周血T淋巴細胞分析采用特異性細胞固定及檢測法，以細胞分離固定技術為基礎，利用抗原抗體特異性反應，通過芯片基板達到將特異性細胞進行固定、分離的目的，完成檢測。該方法與流式細胞術結論相關性良好，檢測結果無明顯差異，同時其操作簡單，使用條件不苛刻。從檢驗學角度，細胞絕對值比百分率更具有臨床價值。除了獲得細胞數量外，玻片可固定細胞，直接觀察細胞形態對其分析。

CD3＋細胞主要參與T細胞信號轉導，但整體水平基數較大，進一步標記的分類繁多，故不足以在治療前后顯示出差異。人體腸道內的免疫系統由復雜的免疫細胞族群構成，既能夠對腸腔抗原形成生理免疫耐受，又可以提供抵御致病原的能力。固有免疫細胞(中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞)與適應性免疫細胞(T細胞和B細胞)在黏膜中的異常滲透是活動期UC的標志性變化。CD4＋的效應T細胞(Th1，Th2和Th17)是對抗病原體的關鍵，而調節性T細胞可以限制效應T細胞的無限擴大和過度反應。調節性T細胞發展缺陷或者免疫抑制屬性的改變將導致T細胞介導的免疫耐受喪失，最終平衡打破從而形成結腸炎癥。清腸化濕方在本實驗中雖然取得較好療效，結腸炎癥減輕，但治療前后外周血CD4＋細胞數并未表現出顯著變化?？赡苡捎贑D4＋的效應T細胞與調節性T細胞的此消彼長，結果從整體水平上變化微弱，所以從CD4＋細胞的更具體分類亞群角度進行研究或許可以獲得進一步的數據。

細胞毒性T細胞和CD8表面蛋白被稱為CD8＋T細胞，CD8＋細胞能夠識別抗原，通過釋放穿孔素與顆粒酶發揮毒性殺傷作用將靶細胞溶解。UC患者的CD8＋細胞水平較高，可引發自身免疫炎癥，造成腸道組織損傷。同時細胞毒性T細胞還能夠產生和釋放促炎細胞因子以及化學因子，例如干擾素γ或者腫瘤壞死因子α，這些因子協助導致上皮細胞溶解，在上皮受到侵蝕的位置造成腸腔內抗原的注入。治療后患者的CD8＋細胞數明顯降低，CD4＋/CD8＋比值明顯升高，闡明了清腸化濕方對于UC患者免疫狀態調節的正面作用。

[1] 陸玥琳，沈洪，姚宏鳳，等.清腸化濕方聯合美沙拉嗪顆粒對潰瘍性結腸炎患者血漿及腸黏膜組織IL－17的影響[J].中國中西醫結合雜志，2014，34(10):1160～1163

[2] 中華醫學會消化病學分會炎癥性腸病學組.炎癥性腸病診斷與治療的共識意見[J].胃腸病學，2012，17(12):763～781

[3] 中華中醫藥學會脾胃病分會.潰瘍性結腸炎中醫診療共識意見[J].中華中醫藥雜志，2010，25(6):891～895

1006－6233(2016)11－1920－03

A 【doi】10.3969/j.issn.1006－6233.2016.11.073

江蘇省中醫院院級課題項目，(編號:Y13053)；國家中醫臨床研究基地業務建設第二批科研專項，(編號: JDZχ2015083)