新型細胞熒光實驗漂染裝置探討＊

賀瓊，郝佳琪，崔佳彬，劉云峰

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新型細胞熒光實驗漂染裝置探討＊

賀瓊1，郝佳琪1，崔佳彬1，劉云峰2

（1.山西醫科大學，山西 太原 030001；2.山西醫科大學第一臨床醫學院，山西 太原 030001）

細胞熒光實驗具有重要的醫學和生物學應用價值，自發熒光的離體細胞可以間接反映在體細胞的生理狀態，是新藥研發、致病機制研究中的關鍵實驗步驟。熒光實驗技術過程復雜，尤其是全程對細胞活性的高要求和暗室操作環境給實驗人員帶來了極大挑戰。在黑暗環境中對活細胞進行熒光染液漂洗是整個流程中最復雜的環節，漂染結果直接決定了實驗能否取得成功。目前的漂染裝置僅適用于普通細胞實驗，無法實現黑暗中精準操作。新型細胞熒光實驗漂染裝置通過玻片、六孔板盒、齒狀夾的組合使用，解決了快速定位染液區，保證細胞活性良好的技術難題，為實驗的高效成功進行提供合理的工具支持。

細胞實驗；熒光染液；實驗裝置；細胞漂染

1 研究背景

細胞熒光實驗是生物醫學領域里一項復雜且意義深遠的技術，其原理是將活體細胞浸泡在熒光染液中，通過化學反應使細胞膜、核膜結構脫致密化，便于脂溶性熒光探針通過細胞膜、核膜上開放的疏松小孔直達染色體，與DNA緊密連接，實現整個活體細胞自發熒光。高亮顯像大大方便了科研人員觀察細胞運動、分裂、凋亡等生理過程，是醫學和生物學實驗技術發展史上里程碑式的突破[1]。

為了避免日光對熒光探針發光亮度的削弱，整個實驗過程包括反復熒光染料漂染及熒光顯微鏡觀察，都需在暗室中進行。暗室環境如圖1所示。

此外，細胞離體后存活時間短，為實現客觀反映細胞的生理狀態，實驗通常需要在2 h內完成[2]。黑暗環境和有效窗口期短兩個特點共同要求實驗員精準且高效地完成每一個步驟。但是目前尚缺乏暗室細胞熒光實驗專用裝置，各課題組多將普通細胞實驗裝置簡單改造后用于暗室熒光實驗，實驗流程缺乏規范性且效率低下。顯微鏡下細胞自發熒光如圖2所示。

圖1 暗室環境（開燈）

圖2 顯微鏡下細胞自發熒光

2 目的和意義

現有細胞漂染過程是用鑷子捏夾附著有細胞的玻片，在染色皿、培養液皿中反復淘洗，完成染色、固色和脫色流程。本新型細胞熒光實驗漂染裝置實現了全程固定玻片，簡化漂染流程的目的。本設計方案以期為相關實驗室提升科研效率、降低實驗成本、保證實驗規范性提供有益幫助。

3 技術方案說明

使用的新型細胞熒光實驗漂染裝置由包括玻片、六孔板盒和齒狀夾三部分構成，三種構件配合使用完成實驗操作。

3.1 玻片部分

玻片主體為圓形，分為中央凹槽狀細胞區和外周平臺區。中央凹槽狀細胞區為熒光染液存儲和細胞染色區域，局部凹陷設計縮小了實際工作區，有助于節省染液，同時限制細胞移動，便于固色。外周平臺區由4個符號和玻片耳柄構成，3個“+”號和一個“P”號共同圍出細胞區，有助于顯微鏡下快速定位細胞，“P”形符號用于維持玻片正向，當“P”號始終向上時，代表整個玻片和內部細胞朝向固定向上。玻片兩端有一對半圓形耳柄，與齒狀夾配合使用移動玻片。玻片共設3種規格，每種規格玻片外形一致，內部凹槽直徑不同，分別為5 mm、10 mm、15 mm，適用于不同大小、不同密度、不同種類細胞的實驗場景。玻片俯視圖如圖3所示。

熒光染色實驗需進行多次染色、漂洗、脫色、固色環節。為了防止細胞在液體反復沖刷下產生移位和損傷，玻片中央細胞凹槽內部進一步對兩處細節進行設計：①凹槽側壁為自外下向內上的斜形走向，與凹槽底面呈60°夾角，內壓形側壁結構形成物理屏障，防止染色和漂洗過程中細胞沖出凹槽；②凹槽底部附有多聚賴氨酸涂層，用于黏附細胞，防止細胞脫落。多具賴氨酸是一種新型生物涂層，具有黏附作用，同時不損傷細胞活性。玻片側視圖如圖4所示。

1—玻片；2—直徑5 mm的凹槽；3—直徑10 mm的凹槽；4—直徑15 mm的凹槽；5—玻片耳柄；6—十字標志；7—“P”形標志。

1—玻片；2—直徑5 mm的凹槽；3—直徑10 mm的凹槽；4—直徑15 mm的凹槽；5—玻片耳柄；8—凹槽側壁。

3.2 六孔板盒部分

六孔板盒的盒體為中空長方體，內部設置中隔將盒體分為左右兩個結構完全相同的區域。兩個區域頂部均有玻片架，玻片架上共有6對半圓形玻片卡槽，可同時承托固定6個圓形玻片，具體如圖5、圖6、圖7所示，實驗員可以在六孔板上同時對6個玻片進行操作，大大提高了實驗效率，此玻片的有序盒內收納也減少了混淆、漏染、誤染、重染情況的發生。

1—玻片；9—六孔板盒；10—玻片架。

9—六孔板；10—玻片架；11—中隔；12—玻片卡槽。

在染色和漂洗細胞時，中空的盒體設計可簡化換液流程。染色時，用移液槍將染液注射到玻片中央凹槽，待細胞著色完成后，用移液槍吸走染液，再向凹槽內緩慢持續注入細胞培養液，當培養液體積超過凹槽容積，液體流經玻片外圍直接流入中空盒體內?？涨缓畜w可暫時儲存漂洗液，無須在水槽中反復進行換液清洗，待實驗徹底完成后，取下玻片，倒空盒體即可。

9—六孔板；10—玻片架；11—中隔；12—玻片卡槽。

3.3 齒狀夾部分

齒狀夾由夾臂、彈簧、中軸、齒狀突起幾個部分構成，具體如圖8所示。夾臂、彈簧、中軸為塑料材質，齒狀突起為軟橡膠材質。齒狀夾夾臂末端有防滑磨砂紋，防止實驗員戴手套后操作滑脫。齒狀突起有利于增大夾臂與玻片的接觸點摩擦力，可有效降低玻片側翻、滑脫的可能性，與使用傳統方法，即鑷子單點平夾玻片相比，玻片耳柄兩端同時受力可實現玻片平穩移動，有助于減少對細胞的物理震蕩。同時，質軟的突起設計便于鉗夾玻片耳柄且不易損傷玻片，延長使用壽命。

13—齒狀夾；14—夾臂；15—彈簧；16—中軸；17—齒狀突起。

4 實施過程

首先評估實驗最終需觀察的細胞數目和密度，以此為依據選擇相應直徑凹槽的玻片，并放入六孔板盒。接下來將活體細胞放入玻片中央的凹槽，用移液槍吸取熒光染液和細胞培養液，反復對細胞進行固色漂洗，洗脫液可直接流入六孔板盒空腔，全程無須移動玻片，僅吸換液體即可完成操作。待染色過程完成后，用齒狀夾鉗夾住玻片兩端耳柄，水平移動到顯微鏡下進行觀察。

5 裝置優點

5.1 精準性

熒光實驗在黑暗環境中進行，科研工作者將實驗細節諳熟于心和使用得心應手的工具是實現精確無誤操作的雙重保險。為配合實驗人員順利完成操作，本裝置在玻片凹槽、玻片表面標志兩方面進行創新：①玻片凹槽。梯形凹槽使細胞局限在固定區域，防止細胞移動滑脫，便于精確觀察細胞。②表面標志。玻片表面“+”和“P”形符號有助于顯微鏡下快速準確定位細胞區域，便于查找。

5.2 穩定性

離體細胞實驗最重要的是保證細胞的活性良好，才能認為所得實驗數據客觀真實地反映了細胞的在體狀態。而確保細胞活性的關鍵是減少細胞移動，但是漂洗過程中多次移動玻片于不同培養皿以及液體反復沖刷，均易對細胞活性造成破壞，導致失活甚至死亡[3]。本裝置不需移動玻片即可完成細胞漂染、縮小的凹槽細胞區減少流動液體量、齒狀夾平穩移動玻片，有效穩固細胞，減少對細胞的人為損傷。

5.3 普適性

玻片凹槽設置3種規格，六孔板盒可同時容納1～6個玻片，科研人員可根據需要自行選擇玻片規格和數量，以適應不同實驗場景。

6 結束語

細胞熒光試驗在醫學領域的重大突破中扮演著重要角色，諸如糖尿病藥物研發、艾滋病防治、人工受精技術研究中都涉及到細胞熒光實驗[4-5]。細胞漂染是整個實驗過程中最關鍵的一步，染色程度直接決定了細胞自發熒光的強弱。染色過淺，細胞發光弱難以定位，染色過深，容易損傷細胞活性，只有染色適當的細胞，才能在顯微鏡下呈現最佳生理觀察效果[6]。本新型漂染裝置是一種專為細胞熒光實驗發明的輔助工具，旨在簡化、精確化、規范化細胞漂染操作。希望以合理的細節設計幫助相關領域的科研人員提高實驗效率，減少人為誤差，得出科學、真實的實驗結論。

［1］季宇彬.熱激活延遲熒光分子探針在生物成像中的研究進展［J］.中國醫藥生物技術，2018（13）：532-538.

［2］楊媛.熒光探針在細胞成像領域的研究進展［J］.功能材料，2018（9）：31-37.

［3］孫靜靜.雜交瘤細胞體外大規模培養研究進展［J］.中國生物工程雜志，2018（10）：82-89.

［4］劉原.間接免疫熒光法在艾滋病合并肺孢子菌肺炎診斷中的應用［J］.中華實驗和臨床病毒學雜志，2014（2）：139-141.

［5］采麗.縱隔原發生殖細胞腫瘤56例臨床病理分析［J］.臨床與實驗病理學雜志，2018（2）：162-165.

［6］賈永梅.核酸熒光探針在單細胞成像中的應用研究［J］. 分析化學，2019（46）：1329-1338.

2095－6835（2019）05－0037－03

Q2-33

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2019.05.037

賀瓊，碩士研究生

劉云峰，研究生導師。

2018年山西省高等學校大學生創新創業訓練計劃項目“鞘氨醇-1-磷酸促進胰島素釋放的鈣濃度調節機制研究”（編號：2018165）

〔編輯：王霞〕