母血中胎兒游離DNA進行地中海貧血的無創產前診斷研究

陳芳+朱斌++周萍

[摘要]目的 探討母血中胎兒游離DNA進行地中海貧血的無創產前診斷價值。方法 選取我院2014年6月～2016年1月的10例地中海貧血妊娠婦女為研究對象，與傳統的羊水穿刺診斷進行比較，采用孕婦外周血血中胎兒游離DNA高通量測序診斷，分析高通量測序方法的檢出率、誤診率、漏診率。結果 胎兒游離DNA高通量測序的檢出率、誤診率及漏診率分別為90.0%（9/10）、0.0%（0/10）和10.0%（1/10），與金標準比較基本一致，可以用于地中海貧血的診斷。結論 胎兒游離DNA高通量測序可以用于地中海貧血的無創產前診斷，對臨床有一定的指導及應用意義。

[關鍵詞]游離DNA；地中海貧血；高通量測序

[中圖分類號] R556.6+1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）10（a）-0111-03

[Abstract]Objective To study the value of non invasive prenatal diagnosis of fetal free DNA in maternal blood.Methods From 2014 January to 2016 January，10 cases of pregnant women with thalassemia patients were selected as the research object.Compared with the traditional diagnosis of amniotic fluid puncture，the detection rate of fetal free DNA in peripheral blood of pregnant women was analyzed，and the detection rate，misdiagnosis rate and missed diagnosis rate of high throughput sequencing method were analyzed.Results Two methods of detection rate，misdiagnosis rate，missed diagnosis rate，fetal free DNA high-throughput sequencing detection rate，the rate of misdiagnosis and missed diagnosis rate were 90.0% （9/10），0.0% （0/10） and 10.0% （1/10），compared with the gold standard was basically consistent，which was used for the diagnosis of Mediterranean anemia.Conclusion High accuracy rate of non invasive prenatal diagnosis of Mediterranean anemia using fetal free DNA sequencing，it can be used for the detection of Mediterranean anemia.

[Key words]Free DNA；Mediterranean anemia；High throughput sequencing

地中海貧血屬于單基因遺傳性的一種慢性溶血病[1]，主要是珠蛋白基因缺失與突變抑制珠蛋白血紅蛋白肽鏈的合成，打破肽鏈平衡[2-3]。在流行病調查過程中發現：α地中海貧血基因的攜帶率為6.0%～7.3%，β地中海貧血基因的攜帶率為1.83%～3.36%，嚴重影響了新生兒的身體健康，造成患兒嚴重貧血或夭折[4-5]。筆者收集我院收治的10例妊娠婦女的臨床資料，并抽取孕婦的外周血以進行診斷與篩查，分析孕婦外周血胎兒游離DNA應用于α地中海貧血產前診斷的效果，并與金標準進行比較，從而確定胎兒游離DNA高通量測序的準確性?，F將研究過程與研究結果匯報如下。

1資料與方法

1.1一般資料

納入標準：2014年6月～2016年1月于我院產前診斷遺傳咨詢門診就診的妊娠婦女，夫妻雙方地中海貧血基因檢測結果顯示為α輕型地中海貧血，均需實施介入性產前診斷明確胎兒地中海貧血基因。排除合并其他疾病的患者，排除患有嚴重其他器官疾病者?；颊咧椴⒃敢鈪⒓颖敬窝芯?。其中年齡20～40歲，平均（29.7±2.5）歲，孕齡13～22周，平均（16.2±1.2）周。

1.2方法

知情告知后，采取孕婦靜脈血5 ml，并進行EDTA抗凝，通過常規方法進行基因DNA的提取，并在50 μl TE溶液的輔助下進行DNA提取，利用PCR-RDB法判斷α地中海貧血基因與突變位點。

1.2.1胎兒游離DNA的提取 靜脈血收集后，進行離心，并將分離后血漿存在離心管中，以13 000 r/min再次進行離心，去除上清，按照試劑盒說明書進行操作，通過采樣柱分離法提取DNA，洗脫液選擇天根生化科技（北京）有限公司提供的1%瓊脂糖凝膠，并對低于300 bp的DNA進行回收[6]。

1.2.2高通量測序中PCR擴增法 引物為F：5′-TATCATGCCTCTTTGCACCATTC-3′；5′-GGCCTAGC？鄄TTGGACTCAGA-3′，211 bp是產物長度，其中涵蓋α珠蛋白基因（HBA1，HBA2）中的突變位點。在反應體系中，上游引物2 μl，下游引物2 μl，buffer 5 μl×10，Taq DNA酶1 μl，DNTP 4 μl，模板5 μl，雙蒸水50 μl，于94℃環境中實施5 min預變性，然后以94℃變性30 s，56℃處理30 s，72℃處理1 min的模式進行循環，結束后再于72℃處理5 min。待聚合酶鏈式反應結束后，模板選擇3 μl產物，實施擴增，與首次保持一致，最后體積為50 μl[7-8]。

1.2.3高通量測序信息分析 原始數據去掉公共測序接頭序列，使用SOAP2進行全目標區域比對，并評價捕獲特異性及覆蓋度；去除重復區域；使用SOAPsnp對基因組測序數據進行SNP信息分析；通過2+1核心家系組合，得到父親及母親的單體型信息；通過父親及母親都是純合但基因型不同的位點計算血漿中胎兒DNA濃度；通過父母單體型信息，根據血漿中的堿基分布，計算得到胎兒的單體型重組信息；通過比較胎兒的單體型是否攜帶致病基因，確定胎兒是否患病或攜帶致病基因[9]。

1.2.4羊膜腔穿刺法 孕婦術前知情告知，排空膀胱，常規消毒鋪巾，于B超引導下抽取羊水15 ml送檢胎兒地中海貧血基因。獲取胎兒地中海貧血基因結果。

1.3評價指標

以羊水穿刺結果為金標準，計算高通量測序方法的檢出率、誤診率、漏診率。

2結果

羊水穿刺結果提示：3例水腫胎，3例HbH病，2例輕型地貧攜帶者，2例地中海貧血基因完全正常。以羊水穿刺結果為金標準，胎兒游離DNA高通量測序的結果中有9例與羊水穿刺結果相同，其中1例羊水穿刺結果提示AA/aa，而高通量測序結果顯示為正常。故其檢出率、誤診率及漏診率分別為90.0%（9/10）、0.0%（0/10）和10.0%（1/10），與傳統的羊水穿刺診斷比較，胎兒游離DNA高通量測序診斷地中海貧血的檢出率較高，對臨床有一定的指導意義及應用意義，且高通量測序方法具有無創性。

3討論

α地中海貧血具有危害大、發病率高等特征[10]，輕型地中海貧血無需治療，重型患者需要長期輸血，且多在幼年夭折，因此α地中海貧血的產前篩查極為重要[11-12]。我國醫療技術不斷發展，產前診斷技術較為完善，但仍有風險。羊膜腔穿刺、臍帶穿刺等有影響胎兒正常生長發育的風險，且會加重孕婦的心理壓力[13-14]。

在早期，通過孕婦外周血胎兒游離DNA高通量測序檢測β地中海貧血的相關文獻資料較少，其已被報道的機制如下[15-18]：①胎兒細胞利用胎盤進入母血中，受母體免疫系統的影響，胎兒細胞DNA會進入母體血漿；②胎兒細胞發生凋亡；③胎盤滋養細胞發生凋亡。孕婦外周血進行胎兒DNA的分離具備快速、簡易、經濟等特點，在保證檢測方法高效性、特異度與敏感度等的同時，簡化操作技術的條件，可在臨床檢測中大范圍地推廣應用。但是該方法無法避免母體DNA對孕婦外周血胎兒游離DNA檢測結果的干擾，導致PCR技術假陽性、假陰性等問題的存在。

研究報道指出，妊娠超過6周后，就可實施胎兒游離DNA的檢測，且其濃度隨著孕周的增加而上升，但是在孕婦分娩幾小時后消失[19-22]。因此孕婦外周血胎兒游離DNA檢測屬于一種新型的產前診斷無創技術，能夠有效提高α地中海貧血胎兒游離DNA高通量測序的準確率。本研究結果顯示，采用胎兒游離DNA高通量測序得到檢出率為90.0%，1例患者發生漏診，漏檢率為10.0%，發生漏診的原因可能是在樣品采集、建庫及上機分析等過程中出現，從而導致胎兒游離DNA高通量測序的漏診，且在實際的操作中也可能出現誤差，從而出現誤診的幾率也會升高，因此在診斷檢測過程中進行5個以上的平行分析，可以減少誤差，在今后的研究中注意在檢測的整個過程中漏診情況的發生。本實驗因經費情況，納入病例較少，如果增加樣本量，應可以大大降低其漏診率。胎兒游離DNA高通量測序是一種無創技術，對胎兒無損傷，對臨床有一定的指導意義，望以后能行大樣本的研究以證實方法學的穩定性。

綜上所述，采用胎兒游離DNA高通量測序進行地中海貧血的無創產前診斷具有一定的臨床應用價值。

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（收稿日期：2016-07-25 本文編輯：王紅雙）