IPS細胞定向分化為造血干細胞關鍵技術的研究進展

曾憲卓+陳帥+王一飛+舒輝萍+張捷+滕嬌+李德智+莫建華

摘要：本文研究了誘導多能干細胞（IPS）分化為造血干細胞的能力。用小鼠骨髓基質細胞OP9與人類IPS共培養，將IPS分化為造血干細胞，用流式細胞術檢測造血干細胞表面標志物的表達水平，實時熒光定量檢測分化過程中IPS與造血干細胞的基因表達水平的變化，用免疫磁珠法分離CD34+造血干細胞檢測細胞的集落形成能力。結果顯示：IPS與OP9細胞共培養誘導造血分化第四天IPS發生了變化，分化得到造血干細胞的表面標志物CD34。分化過程中多能性標志基因Oct4表達下降，造血轉錄因子表達升高，CD34的表達量逐漸升高，集落培養14天后得到紅系集落、粒系集落、巨核系集落等。從而得到結論通過將IPS細胞與OP9細胞共培養，可誘導IPS細胞分化為造血干細胞。

關鍵詞：IPS細胞；分化；造血干細胞

0 引言

目前，臨床上普遍使用造血干細胞移植，用于白血病、非霍奇金淋巴瘤、地中海貧血等病的治療。造血干細胞的主要來源是臍帶血、骨髓。如果直接進行骨髓移植，則需要進行人體的白細胞抗原配型，否則發生免疫排異會危及患者生命?，F有臍帶血庫儲存的造血干細胞免疫原性弱，但數量供不應求，使其在疾病中的臨床應用中受到限制。隨著誘導性多能干細胞（IPS）提取技術的出現，使分化自身細胞變為了現實，不但避免了倫理問題，解決了免疫排斥問題，造血干細胞的數量也能滿足臨床需求。下面將分化研究過程報道如下：

1 材料和方法

1.1細胞株的來源

小鼠骨髓基質細胞OP9購于美國ATCC，誘導性多能干細胞IPS由中科院廣州生物醫藥與健康研究院提供。

1.2試劑和儀器

小鼠骨髓基質細胞OP9的培養基為α-MEM，內含20%的胎牛血清，OP9細胞誘導干細胞分化培養基為α-MEM（15%的DFBS、0.25%胰酶、0.1%明膠），CD34來自MACS公司?？贵w為APS-TRA-1-85，半固體培養基購于SCT公司。流式細胞儀為美國AccuriC6型，定量PCR儀為CFX96型。

1.3方法

在六孔板中先鋪好1%的metrigel進行細胞培養，每三天添加0.5mmol/L的EDTA，以保持對照組細胞的未分化狀態，OP9用細胞培養液培養，培養時放在大小為10cm且鋪有0.1%的明膠的盤里，，每隔四天用胰酶消化傳代。細胞培養溫度為37℃，CO2濃度為0.5，濕度飽和。

OP9細胞進行傳代培養4天后，將OP9的培養液換成誘導干細胞分化的培養液，將UC013細胞洗兩遍后，再對邊緣部位細胞進行消化，將細胞吸出后加入Dispace，再用槍頭吹吸混勻細胞后，將其轉移到加有分化培養液的細胞盤中搖勻，在與上述培養的溫度、空氣CO2濃度和濕度相同的條件下進行培養，培養的第二天將培養液換為共培養液，第四天開始每隔一天半換一次培養液，第九天收樣品。

免疫磁珠法分選CD34+細胞，將細胞用PBS洗兩遍，接著用胰蛋白酶進行消化，制備單細胞懸液，再將細胞收集到離心管中進行離心，收集沉淀，再向其中加入2%血清吹打均勻。過濾后，向其中加入FCR和 CD34標記細胞，30秒后加入流式細胞緩沖液，再離心，然后吸取上清，加入流式細胞緩沖液重懸。將制備好的細胞懸液加入流式細胞儀進行分離，通過流式細胞儀分離柱的CD34-細胞被移出分離柱棄之，最終，通過加壓洗脫分離柱上黏附的細胞，即得到CD34+細胞。

用流式細胞術進行檢測，將共培養9天后的細胞用PBS清洗、胰蛋白酶消化后，制備單細胞懸液，收集到離心管中，靜置五秒后，用加有2%血清的流式緩沖液重懸，細胞過濾后，加入FCR和抗體，孵育15min，再用流式緩沖液清洗，重懸，最后用流式細胞儀進行檢測。

集落形成實驗。將分選的CD34+細胞接種到半固體培養基中，放于培養皿中進行培養，每孔接種1萬個細胞，培養14-16天。然后，在顯微鏡下根據集落成的血細胞形成特征，對集落細胞進行分類和計數。同時，提取共培養2、4、6、8、10和12天的細胞的RNA，用RT-PCR法檢測各基因在細胞中的相對表達量。

2 結果

2.1細胞培養與觀察

觀察培養的細胞，結果顯示，對照組未分化的人體細胞集落狀生長，呈扁平狀，排列緊密，沒有分化的跡象。實驗組培養2天后的細胞，表面布滿細胞集落，已進行造血干細胞分化。OP9細胞貼著細胞壁生長，細胞為三角形，周圍向外出伸出像纖維狀的偽足，細胞排列規則，生長迅速，培養4天后細胞鋪滿了培養皿底。

2.2誘導造血干細胞分化

通過在本實驗組的誘導分化條件下，對實驗組和對照組細胞的培養，實驗組細胞分化到一定程度后，便開始大量克隆，細胞的形態也發生了分化，接著，OP9細胞開始出現老化跡象。

2.3流式細胞術檢測

共培養9天后用流式細胞儀檢測細胞造血表面標志物表達情況，用流式細胞儀分析培養細胞的CD34、CD43、CD31的表達情況，結果顯示表達上述表面標志物的細胞分別占有比例為20%、2%和7.1%。

2.4 4RT-PCR檢測

運用RT-PCR對共培養的細胞進行基因表達檢測，結果顯示，IPS細胞發生造血分化時，Oct-4基因的表達慢慢消失；造血轉錄因子基因表達緩慢升高；Runx-1基因在造血干細胞分化12天當中的表達呈波浪式變化，其中分化第二天表達量最高，第四天開始下降，第八天開始升高；CD34在造血分化過程中的基因表達量逐漸增高。

2.5 CD34+細胞集落實驗

CD34+細胞在半固體培養基中進行培養，根據造血干細胞的形態特征，對細胞集落進行分類和計數。結果顯示，紅系集落（CFU-E）、粒系集落（CFU-G）、巨核系集落（CFU-M）、?！藓讼导洌–FU-GM）集落數量持續升高，混合系集落（CFU-GEMM）的集落數量逐漸降至最低。

3 討論

隨著干細胞技術的發展，通過誘導分化得到造血干細胞已經成為事實。相對于多能干細胞而言，IPS通過導入轉錄因子以及重編程進行定向分化的比例較低，，但是IPS的獲得方法比較簡單穩定，避免了胚胎干細胞面臨的倫理和法律等問題，使IPS可以應用于細胞替代性治療，并可以進行疾病的機理研究和腫瘤治療藥物的篩選。IPS細胞分化得到的造血干細胞免疫原性較低，解決了移植排斥的問題。

在本文的研究中，沒有外加細胞因子，直接將IPS細胞誘導分化為造血干細胞，結果獲得了20%的CD34+細胞，即造血干細胞，CD34是表達于造血干細胞的表面標志物，表明IPS可以分化為造血干細胞，但是轉化率比較低。Runx1是調控造血干細胞分化的轉錄因子，期基因的表達量在分化過程中呈現波浪式的變化，Gata-2的表達則逐漸升高。體外分化得到的造血干細胞在半固體培養基中成集落狀態，說明IPS可以向各細胞系進行分化。

現在多能干細胞分化為造血干細胞的方法主要有：一是形成胚狀體后再進行誘導生成造血干細胞；二是基質細胞與多能干細胞共培養；三是形成EB后與OP9進行共培養；四是單層誘導ESC生成造血干細胞。利用OP9細胞與胚胎干細胞共培養，可以模擬體內的造血微環境，為研究細胞定向分化為造血干細胞創造了可能性，OP9細胞主要支持早期的造血干細胞分化，并協助B淋巴細胞增殖?；|細胞通過釋放的細胞因子支持造血干細胞的分化。這種誘導方法分化時間短，為臨床造血干細胞的移植提供了便利。誘導分化過程中不用添加細胞因子，比較經濟。但該誘導方法也存在著一定的缺點，即存在鼠源性污染細胞的可能性，加之所用血清的成分的不明確性，限制了其在臨床應用。

目前臨床上移植造血干細胞主要是用臍血和骨髓來源的造血干細胞，而體外分化和擴增得到造血干細胞只能通過動物試驗來獲得。將造血干細胞植入重建小鼠體內，可以評價造血干細胞的功能。體外分化獲得的造血干細胞和臍血中的造血干細胞與重建小鼠體內造血系統差異較大，需要進一步優化體外誘導多能干細胞分化為造血干細胞的過程，才能滿足該實驗需求

4 小結

通過將IPS定向分化為造血干細胞的研究，成功誘導了造血干細胞，分化得到的細胞在體外培養中形成了所需的各系集落，本文的研究所采用的技術方法希望可以為IPS細胞在造血疾病中的應用提供一定的實驗依據。

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