黃草烏根部內生真菌的分離與鑒定

尹田鵬+俞靜+王家鵬

[摘要] 目的 從黃草烏的根部分離鑒定內生真菌。 方法 利用PDA培養基進行黃草烏根部內生真菌的分離與純化，根據菌落的形態特征并結合真菌的ITS序列進行菌株鑒定。 結果 從黃草烏根部共分離到內生真菌52株，鑒定為20屬34種，絕大部分屬于子囊菌門，其中鐮刀菌屬和青霉菌屬為優勢屬。 結論 黃草烏根部的內生真菌具有多樣性，可作為潛在的資源供藥物篩選。

[關鍵詞] 黃草烏；內生真菌；鐮刀菌屬；青霉屬

[中圖分類號] R927 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）10（c）-0009-04

[Abstract] Objective To isolate and identify the entophytic fungal in the roots of Aconitum vilmorinianum. Methods PDA medium was used to isolate and purify the endophytic fungi in the roots of Aconitum vilmorinianum. The purified strains were identified by morphology together with ITS sequence. Results Fifty-two strains of endophytic fungi were isolated and identified belonging to 34 species， 20 genera. Most of the isolated fungi are belong to the Ascomycota. Fusarium and Penicillium are the dominant families. Conclusion The entophytic fungi in the roots of Aconitum vilmorinianum are diverse， which can serve as potential resource for drug screening.

[Key words] Aconitum vilmorinianum； Entophytic fungal； Fusarium； Penicillium

黃草烏（Aconitum vilmorinianum Kom.）是毛茛科（Ranunculaceae）多年生草本植物，俗稱大草烏、昆明烏頭，主要分布在云南中部、四川會理及貴州西部，生長于海拔2100～2500 m間山地灌叢中。黃草烏在云南素有“大補藥”之稱，是云南白藥的主要原料之一，可治跌打損傷、風濕等癥[1-2]。黃草烏野生資源豐富，且易栽培，已有人工種植基地。黃草烏根部富含二萜生物堿成分[3-4]，該類成分具有復雜的化學結構和顯著的藥理活性[5-7]。

植物內生真菌（endophyte fungi）是非常重要的微生物資源，幾乎所有植物組織內都存在內生真菌，其發酵產物具豐富的化學多樣性和廣泛的生物活性[8-9]。自Strierle等[10]發現紅豆杉的內生真菌紫衫霉可產紫杉醇后，引發了利用內生真菌來替代原植物的研究熱潮。很多植物中都發現了能夠產和宿主相同結構的活性次生代謝產物的內生真菌，如白喉烏頭根部的內生真菌芽枝狀枝孢（Cladosporium cladosporioides）可產烏頭堿[11]。為保護黃草烏野生植物資源，緩解我國中藥資源日益減少與需求量不斷增加之間的矛盾，本研究對黃草烏根部的內生真菌進行了分離與鑒定，為黃草烏的中藥資源保護和開發利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃草烏新鮮健康植株于2015年10月采集于云南省昆明市盤龍區，由昆明醫科大學楊淑達副教授鑒定，標本（2015-yc-1）保存于云南大學化學科學與工程學院。葡萄糖、瓊脂粉、NaClO購于上海泰坦科技股份有限公司（上海），青霉素及卡那霉素購于阿拉?。ū本?，酒精購于天津化學試劑有限公司（天津）。

1.2 內生真菌的分離與培養

1.2.1 分離培養基 PDA培養基：去皮馬鈴薯200 g煮沸30 min，加入葡萄糖20 g，瓊脂粉12 g，紗布過濾，濾液定容至1000 mL，pH自然，121°C滅菌30 min。

1.2.2 分離與培養 黃草烏的根用自來水沖洗干凈，截成6～8 cm長條，晾干水分后于5% NaClO溶液漂洗60 s，無菌水沖洗三次，然后于75%酒精漂洗60 s，最后無菌水沖洗三次則表面消毒處理完畢。無菌狀態下將根切成2 mm3小塊，置于分離平板培養基（28±1）°C靜止培養，培養基需預先加入青霉素（100 mg/L）和卡那霉素（100 mg/L）以抑制細菌生長。3～7 d后培養基中可見菌落形成，挑取組織周圍的菌落轉接入PDA斜面。采用平板梯度稀釋法純化分得的內生真菌，根據其主要菌落形態特征（菌落大小、顏色、表面特征和質地）和菌體個體形態特征（菌絲、子實體和孢子形態），按微生物分類的不同將同一類群進行歸類。最后將已純化和歸類的菌株分別轉入PDA斜面，在（28±1）°C下培養。

1.3 內生真菌的鑒定

采用插片培養方法對分離的內生真菌進行顯微形態特征的觀察、鑒定，在顯微鏡下觀察子實體特征，結合培養特性，將菌株鑒定到屬。然后依據不同屬的分類標準，參照文獻的方法進行種的鑒定[12]。

1.4 分子生物學信息分析

在PDA平板上恒溫培養內生真菌5 d后在無菌條件下用刀片刮取菌絲至1.5 mL離心管收集菌絲體。在研缽中用液氮充分研磨菌絲體至粉末狀，立即裝入1.5 mL離心管中，用真菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA，置于-20°C冰箱中保存備用。提取基因組DNA后，用引物ITS4進行擴增，擴增產物交由昆明碩擎生物科技有限公司進行測序，測序結果進行Blast比對。

2 結果

從黃草烏的根部共分離得到52株內生真菌，經形態學和ITS分子測定鑒定為20屬34種見表1。從表1中可以看出，分離得到的黃草烏的根部內生真菌絕大部分分布在子囊菌門（Ascomycota）（44株29種）。子囊菌門的菌株在綱、目、科、屬等分類水平上具有豐富的多樣性，分離鑒定的真菌包括子囊菌門的4綱、7目、9科、16屬，其中地絲霉屬（Geomyces）和漆斑菌屬（Myrothecium）在科的水平上未分類[13]。屬于接合菌門的菌株僅有4株2種，都為接合菌綱毛霉菌目毛霉菌科毛霉菌屬。另外有4株3種的真菌屬于擔子菌門，分布于擔子菌門的1綱、2目、3科、3屬中。在綱的分類水平上，糞殼菌綱有24株，占分離總數的46.2%，包括10屬13種。其次為散囊菌綱，有15株，包括2屬12種。在目的分類水平上，優勢目為肉座菌目，具有18株9種的內生真菌，其次為散囊菌目，有15株12種。叢赤殼科和發菌科為黃草烏的優勢菌群，分別有14株6種和15株12種。從屬的層面上看，鐮刀菌屬共分離得到12株4種，是黃草烏內生真菌的優勢屬種；其次是青霉菌屬，有11株9種，曲霉屬有4株3種見表2。

3 討論

李治瀅等[14]曾報道從黃草烏的根和莖中分到12個屬的內生真菌，主要有鐮刀菌屬、毛殼菌屬（Chaetomium）、黑孢屬和青霉屬等。本研究對黃草烏根部內生真菌菌群的分析，從中鑒定了19屬34種的內生真菌，其中有14屬的真菌首次從黃草烏中分離得到。

本研究所得黃草烏根部的內生真菌類群普遍被認為腐生性較強，但是所采集的樣本全部來自健康植株，宿主未表現受到傷害或感染病害的癥狀，應該不會給腐生性真菌提供生長基質。因此認為這些真菌是內生的或至少是部分內生且不引起植物病害，它們符合植物內生真菌的有關定義[15-16]。本研究還發現鐮刀菌屬是黃草烏根部內生真菌的優勢屬種，在本實驗中分離得到的4種鐮刀菌屬的真菌：腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）、燕麥鐮刀菌（Fusarium avenaceum）、三隔鐮刀菌（Fusarium tricinctum）尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. ciceris）均被報道能引起植物病害[17-18]，可以認為是潛伏的致病菌。本研究中亦從黃草烏中分離得到芽枝狀枝孢，該菌曾被報道可產生二萜生物堿類化合物烏頭堿，本研究所分離得到的芽枝狀枝孢是否能在一定的培養條件下產生二萜生物堿則有待進一步研究。

結合文獻報道及本研究的結果，表明烏頭屬植物中的內生真菌具有豐富的多樣性[19-20]。內生真菌的次生代謝產物具豐富的化學多樣性和廣泛的生物活性，烏頭屬植物內生真菌可作為潛在資源供藥物篩選。對黃草烏內生真菌的活性代謝成分進行系統而深入的研究，有利于保護植物資源、開發新型藥物，我們將在今后的工作中有針對性地進行菌株的活性篩選和成分分離。

[參考文獻]

[1] 中國科學院植物志編輯委員會.中國植物志（第27卷）[M].北京：科學出版社，1978：245-246.

[2] Li M，He J，Jiang LL et al. The anti-arthritic effects of Aconitum vilmorinianum， a folk herbal medicine in Southwestern China [J]. J Ethnopharmacol，2013，147（1）：122-127.

[3] Yin TP，Cai L，Fang HX，et al. Diterpenoid alkaloids from Aconitum vilmorinianum [J]. Phytochem，2015，116（8）：314-319.

[4] Tang TX，Chen DL，Wang FP. A new C19-diterpenoid alkaloid from Aconitum vilmorinianum [J]. Chin. J. Org. Chem，2014，34（5）：909.

[5] Yin T，Cai L，Lei G，et al. Two new diterpenoid alkaloids from the roots of Aconitum duclouxii Levl. [J]. Chin J Org Chem，2013，33（12）：2528.

[6] Yin TP，Cai L，Zhou H，et al. A new C19-diterpenoid alkaloid from the roots of Aconitum duclouxii [J]. Natur Prod Res，2014，28（19）： 1649-1654.

[7] 趙永堂.新烏頭堿，烏頭堿與次烏頭堿在附子不同炮制法中含量變化的實驗研究[J].中國醫藥導報，2012，9（5）：27-28.

[8] 周皓，楊亞濱，黎唯，等.植物內生菌中生物堿成分研究進展[J].云南民族大學學報：自然科學版，2015，24（1）：1-9.

[9] Tan RX，Zou WX. Endophytes：a rich source of functional metabolites [J]. Natur Prod Rep， 2001，18（4）：448-459.

[10] Stierle A，Strobel G，Stierle D. Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae，an endophytic fungus of Pacific yew [J]. Science，1993，260（5）：214-216.

[11] Yang K，Liang J，Li Q，et al. Cladosporium cladosporioides XJ-AC03， an aconitine-producing endophytic fungus isolated from Aconitum leucostomum [J]. World J Microbiol Biotechnol，2013，29（5）：933-938.

[12] 魏靜超.真菌鑒定手冊[M].上海：上?？茖W技術出版社，1997：1-571.

[13] Minnis AM， Lindner DL. Phylogenetic evaluation of Geomyces and allies reveals no close relatives of Pseudogymnoascus destructans， combnov.，in bat hibernacula of eastern North America [J]. Fungal Biol，2013，117（9）：638-649.

[14] 李治瀅，李紹蘭，楊麗源，等.滇南黃草烏內生真菌的分離和初步鑒定[J].中國民族民間醫藥雜志，2008，17（7）：10-12.

[15] Wilson D. Endophyte：the evolution of a term，and clarification of its use and definition [J]. Oikos，1995，73（2）：274-276.

[16] 李治瀅，楊麗源，周斌，等.燈盞細辛內生真菌的研究Ⅰ：菌種分離及其分類鑒定[J].云南大學學報：自然科學版，2003，25（1）：65-68.

[17] 張向民.鐮刀菌屬分類學研究歷史與現狀[J].菌物研究，2005，3（2）：59-62.

[18] Yang YB，Yang FF，Miao CP，et al. Antifungal metabolites from the rhizospheric Penicillium sp. YIM PH 30003 associated with Panax notoginseng [J]. Phytochem Lett，2015，11（5）：249-253.

[19] 李治瀅，陳有為，楊麗源，等.川烏植物內生真菌抗菌活性的研究[J].天然產物研究與開發，2009，21（4）：676-678.

[20] 艾嫦，朱妍妍，趙長琦.烏頭屬植物化學成分，藥理作用及其內生菌的研究進展[J].天然產物研究與開發，2012， 24（2）：248-259.

（收稿日期：2016-07-15 本文編輯：趙魯楓）