無菌性腦膜炎主要病原Echovirus 30快速檢測系統的建立

閆強

【摘要】目的：建立一套造成無菌性腦膜炎的主要病原Echovirus 30的快速檢測系統，增加I臨床病例的快速篩查和檢測。方法：通過對Echovirus 30病毒基因組的核酸序列比對，設計出針對Echovirus 30的特異性檢測引物，并對2011年5月-8月間在中國南方地區的一次無菌性腦膜炎爆發流行進行報道和病原檢測。結果：在188例無菌性腦膜炎臨床病例中，98.9%為<1 5歲的兒童。所有標本使用腸道病毒通用引物檢測陽性的為109例，其中使用E30特異性VP1段引物檢測陽性的7 9例，對79株E30的VP1段測序分型顯示，引起本次爆發流行的E 30由Ⅶ型造成，而與Ⅰ-Ⅵ型的同源性為69.8%-87%。結論：本研究成功建立了一套快速、簡便、特異的Echovirus 30檢測系統，并依據該系統第一次報道了在中國南方地區引起無菌性腦膜炎爆發的腸道病毒病原。

【關鍵詞】無菌性腦膜炎；主要病原；臨床

無菌性腦膜炎中有35-83%由腸道病毒引起，其中Echovinm占到80-90%，Echovirus 30（E30）是其最主要的病原體，E30可通過糞-口途徑傳播，感染后通常臨床癥狀不明顯，但也有部分病例可引起急性發熱或神經系統并發癥如腦炎、腦膜炎、胸膜炎、心肌炎、結膜炎等。由E30造成的無菌性腦膜炎在世界范圍內廣泛流行，尤其是最近10年來其爆發流行有逐漸增多的趨勢。

1材料和方法

1.1標本的收集

214份臨床咽拭子標本采自2011年5月22日至8月6日間有無菌性腦膜炎臨床癥狀的病例，咽拭子在標本保存液中充分攪動以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細胞后立即提取病毒RNA或放入-20℃保存。

1.2RNA的提取

從200～1咽拭子中進行病毒RNA的提取，使用磁珠法進行（GenMag Biotechnology，beijing，China），嚴格按照說明書操作，最終使用50μl的DEPC處理的水進行洗脫。提取的病毒RNA直接進行RT-PCR檢測或存放于-80℃備用。

1.3序列分析

測得的序列使用SeqMan軟件（Lasergene package，DNASTAR Inc，Madison，WI，USA）進行拼接。序列比對采用ClustalW方法（MEGA4.0，www.megasoftware.net），基因進化樹構建采用neighbor-joining方法（MEGA4.0，www.megasoftware.net）。

2結果

所有188例臨床病例中有98.9%的病例年齡小于15歲，男女比為23：1（131：57），在年齡分布上本次無菌性腦膜炎爆發中的病例主要集中于3-7歲（88例，46.8%）及10-15歲（48例，25.5%），該年齡分布特點與已報道的手足口病的年齡分布有所不同，手足口病病例主要集中于1-5歲的兒童。在無菌性腦膜炎爆發期間6、7月是其主要流行期，占到所有病例數的85.1%。對本次無菌性腦膜炎暴發流行中的188例臨床病例標本進行5UTR區的腸道病毒通用診斷引物的檢測，共有109例診斷為腸道病毒感染（60%）。其中79例經過E30 VP1特異性檢測引物診斷為陽性。

在GenBank上下載76株之前報道的E30各型及亞型的分離株VP1序列作為參考株與本次無菌性腦膜炎爆發收集的79株E30-VP1序列進行同源性比對，構建進化樹，以核苷酸序列存在12%差異作為基因型的分型標準，所有序列可分為7個基因型（Ⅰ-Ⅶ），各基因型型間核苷酸同源性在63.9%-87.2%之間，型間氨基酸同源性在91.8%-98.6%之間，型內核苷酸同源性在93.7%-97.9%，型內氨基酸同源性在98.4%-99.7%之間，在本研究中分離到的79株E30均為Ⅶ型。

3討論

E30是造成無菌性腦膜炎爆發流行的主要腸道病毒，其流行特點、基因多樣性在歐美和亞太地區有一定報道，但在中國大陸地區對其流行情況的報道則相對較少，其原因主要是還缺乏快速、特異的診斷方法，同時對中國南方地區造成無菌性腦膜炎的E30流行情況也從未進行過相關研究。在2011年春夏季節，在中國南方的廈門市及周邊地區出現了一次無菌性腦膜炎的爆發流行，我們通過建立一套針對性較強的快速診斷系統，并對臨床標本直接進行PCR擴增從而證明該系統具有較好的檢測靈敏度和準確性，從而確定此次爆發中E30均為同一基因型，提示較好的監控手段將有利于新的暴發流行的控制和預防。