miR-26a促骨再生機制及其應用研究進展

楊雅婷 綜述 于子優 張文杰 審校

miR-26a促骨再生機制及其應用研究進展

楊雅婷 綜述 于子優 張文杰 審校

誘導自身骨再生是修復大面積骨缺損的理想手段。miRNAs作為一種轉錄后水平的調控因子，能夠調控一系列靶基因的表達。研究表明，miRNA-26a（miR-26a）能夠同時促進與成骨-成血管相關的多個關鍵生長因子的表達，進而促進間充質干細胞成骨分化和骨再生。闡明miR-26a在干細胞成骨分化中的具體分子機制，有助于開發促進骨組織再生修復的新靶點。本文就目前miR-26a促進間充質干細胞成骨分化的調控機制和應用進展進行綜述。

miR-26a 間充質干細胞 成骨分化

骨創傷或骨腫瘤等引起的大面積骨缺損，理想的修復方法是誘導自身骨再生。近年來，干細胞技術的發展使得利用多種來源間充質干細胞（Mesenchymal stem cell，MSC）分化成骨變為可能。傳統的促進MSC成骨分化的方法為添加成骨相關調節因子，如BMP2等，雖能夠促進骨再生，但存在添加物降解過快以及難以控制再生程度等問題。此外，外源性干預手段可能會打破骨重建過程中骨形成與骨吸收之間的平衡，以及血管新生與血管改建之間的平衡，從而導致過量新生骨生長，也有可能因大量不成熟的血管形成而造成血管高壓及血管微滲漏[1-2]。開發促進骨組織再生修復的新靶點，在最大程度上模擬自然狀態下的成骨分化調控，已成為當前該領域研究的熱點。

miRNA是由22個核苷酸組成的內源性非編碼RNA分子，在轉錄后水平負向調控靶基因表達或阻遏翻譯[3]。近年的研究表明，miRNA對成骨與成血管相關的轉錄因子和信號分子具有重要的調節作用[4]，與多種信號通路共同構成了干細胞成骨-成血管分化的調控網絡[5-6]。研究認為，miR-26a能夠調控多條成骨分化通路，同時促進內源性成骨-成血管相關的多個關鍵生長因子的表達，在不同來源的干細胞中發揮其促成骨分化潛能[7]。闡明miR-26a在干細胞成骨分化中的具體分子機制，有助于開發骨組織工程修復的新靶點。本文就目前miR-26a在促進干細胞成骨分化的調節通路方面的研究以及相關技術的應用進行綜述。

1 miR-26a調控干細胞成骨分化的通路

miR-26a調控干細胞成骨分化的通路比較復雜，大致涉及 Sma-Mad族蛋白 1（SMAD1）、erbB2轉錄因子（transducer of ErbB2，Tob1）、WNT（Wg-int1）、糖原合成酶激酶 3β（Glycogen synthase kinase-3，GSK-3β）等，不同研究應用了不同來源的MSC開展了探索[8-14]。

1.1 SMAD1

Luzi等[14]觀察到人脂肪組織來源間充質干細胞（Humanadipose tissue-derived mesenchymal stem cells，hADSCs） 在成骨分化過程中mir-26a表達增加，而SMAD1蛋白的表達則與之相反，通過2'-O-甲基-反義RNA能夠增加SMAD1表達水平，使hADSCs中成骨標志基因上調，由此推測，mir-26a通過作用于SMAD1蛋白在hADSCs成骨分化過程中扮演重要角色。在另一項對hADSCs和骨髓來源間充質干細胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs） 成骨分化的研究中，通過生物信息學預測和功能試驗，明確了mir-26a通過潛在靶向性作用于GSK3β和Smad1來調節WNT和BMP信號通路。其中，綜合比較分析顯示，在ADSCs成骨分化中抑制Smad1以抑制BMP通路引起的干擾分化過程占主導[11]。此外，Luzi等在對調控SMAD1上游的Menin的研究中也報道了mir-26a參與的調節過程。Menin是多發性內分泌腺瘤致病因子 1（Multiple endocrine neoplasia 1，MEN1）抑癌基因的產物，具有廣泛調節轉錄的功能[15]。通過采用熒光素酶表達質粒pGL3/miR-26a，證實了Menin-miR-26a的特異性相互作用，通過小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）將hADSCs中MEN1沉默會引起miR-26a的下調，最終導致SMAD1蛋白的上調，進一步分析發現，隨著mir-26a的減少SMAD1蛋白出現上調，證明SMAD1是mir-26a在hADSCs成骨分化中的直接靶點[10]。分析hADSCs成骨分化階段Menin及其mRNA的表達，兩者都有所上升，與成骨標記基因如RUNT相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）、骨鈣素（Osteocalcin，OCN）等平行變化。 染色質免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）分析顯示，Menin占據miR-26a基因啟動子，因而誘導它的表達，明確了Menin是一種miR-26a的正向調節因子。這些研究證實，Menin轉錄因子和miR-26a之間有直接相互作用，這在hADSCs成骨過程中可能起到關鍵作用，為miRNAs在骨疾病中的治療提供了一個新的靶點。研究表明，在地塞米松誘導的hADSCs成骨分化過程中，Menin是一種對miR-26a直接調控，對SMAD1蛋白間接調控（通過miR-26a）的調控因子[16]。

1.2 Tob1

李巖等在卵巢摘除（Ovariectomy，OVX）骨質疏松疾病模型中發現，miR-26a通過功能性的靶向作用于Tob1，逆轉了OVX-MSC的成骨能力缺陷。在OVX-MSC中上調miR-26a的表達，使成骨分化的關鍵性生長因子堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）OCN表達增高，預測 Tob1的非編碼區（3‘UTR）存在miR-26a的結合位點。將OVX-MSC與Sham-MSC成骨誘導分化后，觀察到在兩種細胞中Tob1的表達均呈現逐漸降低的趨勢。將建立的野生型或突變型的報告基因載體與miR-26a mimics共轉染至MSC后，觀察到miR-26a的過表達明顯抑制了野生型Tob1報告基因載體的熒光素酶活性，而對突變型并無改變。同時，觀察到miR-26a的過表達明顯抑制Tob1蛋白在MSC中的表達，而對其基因表達無明顯影響，細胞中成骨分化相關的關鍵性生長因子隨Tob1表達的升高而明顯下降[8]。該研究證明了miR-26a是通過功能性直接作用于Tob1，部分逆轉了OVX-MSC的成骨能力缺陷。這種逆轉能力在體內異位骨以及原位顱骨缺損修復中都得到了證實。此外，在對非限制性成體干細胞（Unrestricted somatic stem cells，USSC）成骨分化的研究中，生物信息靶向基因預測miR-26a抑制成骨的蛋白轉錄編碼，隨后證實Tob1也是靶點之一[13]。

1.3 WNT

miR-26a在WNT通路中的作用尚存在爭議。在Su等[11]的研究中，通過生物信息和功能試驗，明確了miR-26a通過潛在靶向性作用于GSK3β和Smad1來調節WNT和BMP信號通路。綜合比較分析顯示，WNT信號通路在BMSCs成骨分化中較BMP信號通路占主導，而后者在ADSCs成骨分化中起更大作用。這種分離的激活模式以及在信號通路中的作用，說明miR-26a主要靶向作用于GSK-3β以激活WNT信號通路，進而促進BMSCs的成骨分化，而在ADSCs成骨分化中則抑制Smad1，從而抑制BMP通路以干擾分化過程。但Li等[12]的研究認為，miR-26a-5p上調后通過直接靶向作用于Wnt5a的3＇非轉錄區（UTR）而抑制成骨分化，進而下調Wnt/Ca2+信號通路，生物數據算法提出Wnt5a的3＇UTR段是miR-26a-5p的潛在靶點，通過采用雙熒光素酶報告基因分析和綠色熒光蛋白/紅色熒光蛋白（GFP/RFP）染色試驗證實了這一預測，發現miR-26a-5p抑制Wnt5a，抑制鈣離子流和蛋白激酶C，進而抑制ADSCs的成骨分化。相比之下，miR-26a-5p的抑制可以激活這些信號蛋白，促進成骨分化。

1.4 GSK-3β

有研究表明，Gsk-3β存在miR-26a的結合位點，而抑制GSK-3β可促進骨修復，顯著提高OVX小鼠的礦物沉積率（Mineral apposition rate，MAR）和骨礦物質密度（Bone mineral density，BMD）[17-18]。為探究GSK-3β在調節成骨活性中的角色，沉默小鼠 MSCs和成骨細胞（Osteoblasts，Obs）中 GSK-3β的表達后，Runx2和OCN蛋白水平明顯升高。通過添加miR-26a的模擬物和抑制劑，進一步驗證miR-26a在其中的調節作用，結果表明，Runx2、OCN、Gsk-3β的表達在miR-26a過表達細胞中提高，在miR-26a抑制組中降低，證實了miR-26a通過功能性靶向作用于GSK-3β，上調成骨細胞活性[9]。ADSCs和BMSCs成骨分化的比較研究也證實，miR-26a主要靶向作用于GSK3β以激活WNT信號通路，進而促進BMSCs的成骨分化[11]。

1.5 其他

在miR-26a表達變化與成骨相關關鍵調節因子、成血管相關關鍵調節因子的表達關系的研究中發現，BMP2、RUNX2及OCN等與miR-26a的表達水平變化一致，通過堿性磷酸酶與茜素紅染色觀察到，miR-26a過表達有效促進了BMSC的磷酸酶活性與礦化能力。進一步研究發現，成骨相關關鍵調節因子（RUNX2，OCN）與成血管相關關鍵調節因子（血管內皮生長因子和血管生成素）在蛋白水平的表達也隨著miR-26a表達的上調與下調而上升與下降[8]。上述結果表明，miR-26a體外可以在BMSCs細胞中有效地從基因與蛋白兩個水平促進成骨-成血管相關關鍵調節因子的表達與分泌。

除了影響成骨、成血管關鍵生長因子，在miRNAs對USSC成骨分化的功能性影響研究中，還闡述了內源性CDK6和HDAC4的水平在USSC成骨分化過程中下調，減少了隨后mir-26a的異位表達。通過Alizarin-Red染色和鈣離子釋放試驗表明，過表達mir-26a能顯著加快USSC的成骨分化，推測可能由成骨抑制蛋白，如周期蛋白依賴性激酶（Cyclindependent kinases，CDK6）和組蛋白去乙?；?4（Histone deacetylase 4，HDAC4）介導。證實成骨抑制因子CDK6、重組人 β-連環素蛋白互作蛋白 1（CTNNBIP1）、HDAC4 和 TOB1，還有SMAD1也是miR-26a的靶點[13]。

2 miR-26a在骨缺損修復中的應用

miRNAs有望作為骨缺損修復的新靶點。與傳統的細胞因子或生長因子治療相比，調節單個水平的miRNAs有望同時影響骨修復中的多條途徑。miRNAs治療可以通過直接給予miRNAs的模擬物或抑制物，但通常這些帶負電的小分子不能輕易通過同為負電的細胞膜[19]，而裸露的miRNAs在體內很快就會被降解。因此，找到合適的載體及遞送系統將miRNAs高效地轉運至細胞中，是目前miRNAs治療面臨的最大問題。以miR-26a在骨缺損動物模型中的應用為例，近年來已在miR-26a遞送體系方面有所突破，并聯合支架材料的應用，在骨缺損修復中展現了良好效果。Wang等[20]的研究發現，ASCs被透明質酸（HA）支架吸收后，可作為新型組織工程骨替代品嵌入脛骨極限缺損的大鼠。隨著miR-26a的轉入，成骨相關基因表達極大上調，ALP的產生、膠原的分泌和細胞外基質礦化都有所增加。HE染色觀察到新骨形成，而細胞的形態學表現和增殖并未受到明顯影響。組織學評估觀察到，附著于多孔HA支架的修飾細胞明顯促進了新骨在缺損區域的形成。李巖等[8]基于聚醚、聚酯材料，利用聚合和點擊化學方法，合成出生物可降解的效率高、毒性小的陽離子miRNA轉染體系（線性LPs和超支化HPs），可以在miRNAs穿過細胞膜時不被降解，進入細胞后囊泡膨脹和破解，miRNAs進入細胞質。隨后，通過將上述miRNAs轉染體系包裹于聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）緩釋微球中，再將微球附著于左旋聚乳酸（PLLA）納米多孔支架上，構建了miRNAs局部緩釋體系。在5 cm脛骨極限缺損模型中，原位植入緩釋體系的實驗組活體micro-CT顯示骨缺損完全修復 （對照組僅有少量或中等量的骨修復）。該結果經過micro-CT對新生骨量的半定量檢測進一步得到確認。HE染色觀察到實驗組中新生骨量及新生血管的密度與數量都遠高于兩個對照組。綜合實驗結果表明，該miRNAs緩釋體系能夠在體內環境中實現對Agomir-26a的有效緩釋，并同時保持其良好的生物學活性，進而有效轉染至缺損區周圍細胞，促進缺損區周圍機體自身細胞中的成骨-成血管相關關鍵調節因子的表達與分泌，最終以內源性的調節手段實現最理想的骨缺損修復效果。而在Zhang等[9]的無細胞3D支架和兩階段遞送研究中，短的PEG鏈和一個低分子量的正電PEI結合在一個疏水分子核心的外殼上，miRNAs引起進一步的自我募集，形成一個納米級球形外殼，被內外兩層親水PEG層夾成三明治結構。這些穩定攜帶miR-26a的多聚體被包裹在可生物降解的多聚體微粒（MS）中，克服了現有miRNAs轉運體系的不受控釋放引起的問題。這種兩段式miRNAs轉運策略使得在受控持續釋放的基礎上保有高轉染率。此外，為防止miRNAs轉運過程中的靶向外效應，通過把MS移到一個納米纖維無細胞3D支架上，可以從時空上控制內源細胞的活化，從而再生修復骨質疏松的老鼠的顱骨缺損。

3 展望

遞送系統和細胞來源的缺乏是目前miR-26a應用于骨缺損治療的主要瓶頸。移植過程中，設計的骨架不僅受制于骨細胞，還要應對炎癥和成血管細胞滲透。支架降解引起的不良反應在用較大劑量進行缺損骨骼修復時可能會被放大，而修復大面積骨缺損可能會用到超生理劑量的miR-26a，從而可引發不可預知的結果。因此，炎癥和成血管細胞是如何受到miR-26a調控，以及又是如何作用于成骨過程等問題，仍需進一步研究[21]。BMSCs雖然能分化成多個細胞系卻難以大量獲得，盡管體外擴增可以增加細胞數量，但長期增殖和持續傳代，對BMSCs的正常功能存在有害效應[20]。相比之下，源自脂肪組織的ADSCs易大量獲取，被認為是干細胞的更可靠來源。然而，盡管能被HA支架或其他支架吸收，ADSCs的成骨分化能力整體受限。研究表明，miRNAs是強大的內源性治療分子，可以同時調控多種靶基因，在體內的應用可以更好模擬自然調節通路，正如其在細胞中本身的功能，具有改善ADSCs功能的潛力[20]。但是，目前的研究發現，miR-26a在BMSCs和ADSCs兩種細胞中的功能有著重疊和矛盾，提示在MSC細胞分化中有著不同的轉錄后調解路徑[8]。因此，很多在BMSCs、USSC中的關于miR-26a促進成骨機制的研究，需要進一步在ADSCs中進行驗證和深入研究。此外，miR-26a在ADSCs成骨分化中扮演的角色以及ADSCs成骨分化的具體分子機制還有待進一步闡明，相關通路的明確可以為骨組織再生修復提供新靶點和新方法。

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The Molecular Mechanism and Application of miR-26a in Bone Regeneration

YANG Yating,YU Ziyou,ZHANG Wenjie．Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:ZHANG Wenjie(E-mail:wenjieboshi@aliyun.com).

【Summary】The ideal means to repair large-sized bone defects is to induce bone regeneration.MicroRNAs(miRNAs),as a modulator at a post-transcriptional level,can regulate the expression of a series of target genes.A number of studies have shown that miR-26a could promote the expression of multiple key growth factors related to osteogenesis and angiogenesis,and further improve the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells and bone formation.Clarifying the molecular mechanism of miR-26a in promoting osteogenic differentiation of stem cells could provide potential targets for bone regeneration.The mechanism and current progresses of miR-26a in promoting osteogenic differentiation and bone regeneration were reviewed.

miR-26a;mesenchymal stem cell; osteogenic differentiation

Q813.1+2

B

1673－0364（2017）06－0346－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.06.013

200011 上海市 上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院整復外科，上海市組織工程研究重點實驗室。

張文杰（E-mail：wenjieboshi@aliyun.com）。

2017年8月23日；

2017年10月10日）