聯合T、B細胞表位設計多肽疫苗的研究進展①

李少華 唐 康 張春梅 金伯泉 馬 櫻

(第四軍醫大學基礎部免疫學教研室，西安710032)

·專題綜述·

聯合T、B細胞表位設計多肽疫苗的研究進展①

李少華②唐 康 張春梅 金伯泉 馬 櫻

(第四軍醫大學基礎部免疫學教研室，西安710032)

從Adam等[1]發現針對口蹄疫病毒的多肽疫苗，到Lerner[2]建立多肽疫苗合成的方法，再到聯合T、B細胞表位多肽疫苗設計的出現，新型疫苗的研制快速發展。聯合T、B細胞多肽表位是指將已證實或預測得到具有免疫原性的T、B細胞多肽表位通過生物、化學方法連接，或同時串聯通用CD4+T細胞表位以增強T、B細胞表位的免疫原性，從而形成的人工合成多肽表位。由于單一表位免疫原性弱，而聯合T、B細胞多肽表位可同時誘導體液免疫及細胞免疫應答，因此成為目前多肽疫苗研究的熱點。國內外應用聯合多肽表位設計疫苗在抗感染及抗腫瘤等方面已有諸多報道，本文將對聯合多肽表位的選擇、連接方式、疫苗的設計以及在疾病模型中的研究和應用等方面的進展進行全面綜述。

1 T、B細胞表位及通用Th細胞表位

1.1 T、B細胞表位 T細胞表位是指能與MHC分子結合并被T細胞受體(T cell receptor，TCR)識別從而激活特異性T淋巴細胞的一類多肽，分為CD4+T細胞表位和CD8+T細胞表位，前者一般為13～17個氨基酸的短肽，結合MHC Ⅱ 類分子，而后者一般為8～10個氨基酸的短肽，結合MHC Ⅰ 類分子。B細胞表位是指能被B淋巴細胞表面B細胞受體(B cell receptor， BCR)識別并能誘導其產生中和抗體的多肽，包括線性表位與構象表位。其中B細胞以識別構象表位為主，但由于技術的限制，目前人工篩選用于多肽疫苗的B細胞表位絕大部分為線性表位。

1.2 通用Th細胞表位 多肽疫苗具有特異性強、安全性高及容易保存等優點，但也因免疫原性較弱、半衰期較短以及MHC限制性等因素影響了其免疫效果。Sinigaglia等[3]在1988年報道了一種來源于惡性瘧原蟲的蛋白多肽且能夠與多種人和鼠的MHCⅡ類分子結合從而激活多個克隆Th細胞的肽段，其序列為DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS，并將這類較為保守的肽段命名為通用Th細胞表位。之后科學家們又陸續發現了其他一些與通用Th細胞表位具有相似作用的多肽序列。1999年，美國聯合生物醫學公司根據通用Th細胞表位可作為多肽表位免疫刺激物的特性申請了專利。目前已應用于實驗研究的主要通用Th表位有PADRE和破傷風類毒素與白喉類毒素等。

1.2.1 PADRE 1994年，Alexander等[4]通過引入適當的錨定殘基合成了6條十三肽，親和力分析以及一系列體內外實驗證實合成的十三肽可具備不受MHCⅡ類分子，尤其是HLA-DR分子限制的能力，并且它們誘導T細胞應答的能力是天然表位的一千倍以上。由于該組肽段中有兩條十三肽與HLA-DR、DQ親和力非常高，因此他們將這些合成肽段命名為泛DR表位(Pan DR epitope，PADRE)，并且預測了PADRE將在新型多肽疫苗的研制中具有重要的應用前景。目前應用較多的是序列AKFVAAWTLKAAA。

1.2.2 破傷風類毒素與白喉類毒素 Diethelm-Okita等[5]在研究破傷風類毒素上T細胞表位時，發現其中兩個表位肽能夠激活預先建立的任意一組T細胞克隆，隨后應用隨機T細胞對破傷風類毒素來源的兩個肽段以及白喉類毒素來源的7條肽段進行分析，發現這些肽段均具有相似的通用Th細胞表位功能，目前破傷風類毒素來源的兩條肽段IDKISDVSTIVPYIGPALNI和NNFTVSFWLRVPKVSASHLET的應用最為廣泛。另外，還有一些通用Th細胞表位應用于某些病毒感染性疾病疫苗的設計中，例如HIV聯合表位肽疫苗設計中使用的pol711等[6]。

2 多肽抗原表位的連接方式

2.1 直接連接模式 直接將多個T細胞或B細胞表位首尾相連得到的串聯多肽表位，多采用CTL表位的N端連接B細胞表位C端，B細胞表位N端再連接通用Th細胞表位C端，中間可以重復連接。各表位之間以柔性linker如3～5個甘氨酸連接以防止新的抗原表位形成。該連接方法可以有效增強抗原多肽表位的免疫原性，同時又可以做到對各個抗原表位的準確定量。但一般需要串聯30～40個以上的氨基酸才會具有較好的免疫原性[7]。

2.2 多抗原肽模式 Tam等[8]在1988年報道了將多個表位連接于多聚賴氨酸骨架的分支上從而獲得聯合多肽表位的方法。該連接方法可以使表位在空間上充分展開，不需載體即可顯著提高免疫原性，但合成費用較高，如Liao等[9]在研究來源于人端粒逆轉錄酶(hTERT)的表位肽連接時，將其中3個CTL表位分別連于賴氨酸骨架上，并在體外實驗中證明其激發抗腫瘤免疫應答的效果較線性表位更強。

2.3 脂肽模式 通過將各T、B細胞表位共價連接于具有佐劑活性的脂質分子上從而構建獲得多肽表位。脂質分子穩定且具有親脂性，該方法可使聯合表位獲得親脂性從而更容易進入細胞內，例如Wilkinson等[10]將脂質佐劑、人表皮生長因子2(HER-2)或黏蛋白1(MUC1)、PADRE以及腫瘤相關糖類抗原(TACA)串聯在一起構建成為self-adjuvanting腫瘤糖肽疫苗，并在小鼠體內實驗中證實該連接模式可優化表位的排列，使其更容易被樹突狀細胞加工提呈。

2.4 表位基因重組表達模式 將編碼表位肽的核苷酸序列通過適當的方式串聯起來，與細菌質粒重組后，通過真核表達系統表達出重組多肽表位。該方法中序列的串聯需要保證每個編碼表位的基因序列可被正確閱讀、翻譯和有效終止，同時也需要選擇合適的表達載體和啟動子。這種方式由于可以量產，也得到了廣泛的應用，但步驟較多且需要進一步純化[11]。

3 聯合多肽表位在多種疾病疫苗設計中的研究與應用

3.1 在抗寄生蟲疫苗設計中的應用 寄生蟲多肽疫苗的研究絕大多數是針對剛地弓形蟲與瘧原蟲的研究。聯合T、B細胞表位的疫苗設計在抗瘧原蟲中已有研究，例如Powell等[12]應用惡性瘧原蟲蛋白上的T細胞表位、B細胞表位重復3次，與同源通用Th表位連接，末端再串聯20個賴氨酸殘基及一個酪氨酸殘基組成的21肽，最終獲得的肽段在以碳酸鈣為核心的微粒表面形成薄膜展開，稱之為layer-by-layer (LbL)微粒，用LbL免疫小鼠后測定中和抗體和特異性CTL，結果證實該肽段可誘導較強的免疫保護作用。El Bssati等[13]將組氨酸標簽his-tag、CTL表位及多重卷曲肽段(包含PADRE)等連接在一起構成能夠自我組裝成顆粒的肽段，用于設計針對剛地弓形蟲的多肽疫苗，在HLA-B*0702的轉基因小鼠中證實該肽段激活CD8+T細胞應答的能力較強[13]。Mahajan等[14]在研究針對惡性瘧原蟲的多肽疫苗中，將瘧原蟲子孢子、紅內期、紅外期T、B細胞表位采用不同的大量重復串聯方式構建成為3種多抗原肽(MAP-1、2、3)，并證明這3種多抗原肽在小鼠體內可不同程度抑制紅內期瘧原蟲的生長。

3.2 在腫瘤疫苗設計中的研究 在新型腫瘤疫苗的研究中，聯合多肽表位疫苗設計目前已有廣泛應用，其中T、B細胞表位主要來源于腫瘤中人端粒逆轉錄酶hTERT、糖脂蛋白GLP、黏蛋白MUC以及HER-2分子等。PADRE等通用Th表位也應用于串聯表位腫瘤多肽疫苗設計中，例如，Bettahi等[15]將來源于卵白蛋白的CTL表位、PADRE、糖類B細胞表位、棕櫚酸(PAM)連接并搭載于GLP上構建針對小鼠B16黑素瘤的多肽疫苗OVA-GLP，在小鼠荷瘤模型中發現其可有效抑制腫瘤生長。隨后用來源于HER-2的CTL表位替換卵白蛋白CTL表位，從而構建成為HER-GLP-1線性GLP疫苗，并將PAM連接在CTL表位和PADRE之間得到具有分支結構的HER-GLP-2疫苗分子，實驗證實HER-GLP-1能更好地被樹突狀細胞提呈，并能刺激產生更高頻率的IFN-γ及更強烈的CTL應答，而HER-GLP-2則能刺激B淋巴細胞產生更高水平的特異性IgG，該研究結果對制備針對乳腺癌的多肽疫苗及其臨床治療都具有重要意義[16]。Cai等[17]將來源于MUC1的B細胞表位與破傷風類毒素P2連接構建聯合多肽表位，并與PAM連接，實驗證實其在沒有佐劑輔助的情況下也能刺激小鼠產生針對MUC1的特異性抗體。Nezafat等[18]構建了一種針對腎母細胞瘤(Wilms瘤)的新型聯合表位肽疫苗，將軟件預測獲得的分別來源于Wilms瘤和人乳頭瘤病毒(HPV) E7的兩種CTL表位、PADRE和破傷風類毒素C段(TTFrC)連接，使用TLR4受體激動劑肝磷脂血凝素作為佐劑，促使CD4+T細胞向Th1轉化，各肽段之間通過AAY及EAAAK等linker連接，通過對其3D結構進行分析，發現其表面可形成多個線性及構象B細胞表位，因此具備同時激活體液及細胞免疫應答的能力。Mahdavi等[19]將來源于HER-2的T、B細胞表位連接并通過GLSP linker再連接一個來源于麻疹病毒的通用Th細胞表位，從而構建得到針對乳腺癌的聯合多肽表位，免疫小鼠后體內實驗證實其誘導的免疫應答可有效抑制腫瘤細胞增殖。Wu等[20]將來源于人表皮生長因子受體(EGFR)的B細胞表位和來源于麻疹病毒的通用Th細胞表位編碼序列重組表達得到MVF-EGFR的嵌合肽段，并證實其在小鼠體內可刺激產生針對EGFR的高滴度抗體。

盡管諸多研究已表明聯合多肽表位在腫瘤多肽疫苗的研究中具有一定的應用前景，但目前大部分腫瘤多肽疫苗的設計還集中于CTL表位或B細胞表位串聯通用表位的研究，三者串聯構建聯合多肽表位的應用還有待深入研究。

3.3 在抗病毒疫苗研究中的應用 應用重組表達病毒抗原聯合多肽表位的方法，即通過選擇病毒多肽抗原表位，獲得其DNA序列，擴增后插入質粒，導入表達細菌得到目的肽段，如Kulkarni等[21]將分別來源于日本腦炎病毒(JEV)包膜蛋白和非結構蛋白1的5種表位按B1TH1、B2TH3、B1TH2、TH3B1的組合方式連接，表達后得到肽段P-JEV即為針對JEV的聯合抗原表位。Li等[22]設計的針對JEV的多肽疫苗則包含PADRE，并且在肽段N端連接纖維蛋白溶酶原活化劑(TPA)以促進肽段的溶解、分泌與折疊，同時連接CpG基序以增強多肽表位的免疫原性，最終形成包括PADRE、兩種T細胞表位以及4種B細胞表位的聯合多肽表位疫苗，實驗證實其在小鼠體內可誘導產生高滴度抗體與高水平T細胞應答。Wei等[23]將針對甲型H1N1豬流感病毒的T、B細胞表位各兩個重組表達，并在兩個B細胞表位之間通過KK作為linker，在兩個T細胞表位之間通過RKR作為linker連接，在整個肽段的C端增加牛皰疹病毒1型的衣殼蛋白作為載體，實驗證實在小鼠體內可有效激發體液與細胞免疫應答。Wang等[24]將6個B細胞表位、4個Th細胞表位以及兩個CTL表位插入2型皰疹病毒的糖蛋白D中，將其中的某些非表位肽段替換，應用重組方法得到針對2型皰疹病毒的聯合多肽表位肽段，免疫小鼠后證實其誘導的免疫應答可降低感染率或減輕感染癥狀。

將病毒抗原的各T、B細胞表位直接連接獲得聯合表位多肽作為候選疫苗分子進行免疫，也可誘導高水平的T細胞應答及抗體產生。Monso等[25]設計的針對口蹄疫病毒(FMDV)的聯合多肽表位，先將四個B細胞表位并聯于T細胞表位形成B4T肽段，發現B4T誘導CD1小鼠產生中和抗體能力較強。隨后直接將兩個B細胞表位連接于三肽KKK再連接通用Th細胞表位即B2T，發現B2T誘導免疫應答的能力更強[26]。Kashi等[6]則是直接在病毒蛋白的適當位置插入通用Th表位，如在HIV-1的反式激活蛋白(Tat)中富含Cys的結構域和堿性結構域中插入PADRE或Pol711，該方法既降低了Tat激活HIV基因轉錄的作用，也增強了其本身的免疫原性，免疫小鼠后證實Th1、Th2以及B細胞的免疫應答均有所增強[6]。

3.4 在抗細菌多肽疫苗設計中的應用 Mohamud等[27]構建的重組卡介苗(rBCG)包括兩個多肽，rBCG018和rBCG032，前者將三種來源于Ag85B的T細胞表位連于Mtb8.4上，后者將來源于ESAT-6、CFP-10、MTP40蛋白的B細胞表位連于rBCG018，對rBCG與BCG誘導免疫應答的能力進行比較發現rBCG誘導細胞免疫及體液免疫應答的能力均強于BCG。Farjaha等[28]利用軟件預測得到來自銅綠假單胞菌的多肽序列，證實其既包含B細胞表位又包含T細胞表位，將藻朊酸鹽連接于該肽段，在小鼠肺炎模型中發現，用該肽段免疫后的小鼠發生急性肺炎的比例明顯下降。Lin等[29]將預測得到的鉤端螺旋體外膜蛋白OmpL1和LipL41的四個T、B細胞表位重組連接，免疫小鼠后發現CD4+T細胞，尤其是Th1細胞的應答顯著增強。

需要注意的是，并非所有T、B細胞表位均可作為多肽疫苗設計的候選表位，例如在阿爾茨海默癥的研究中發現，針對Aβ的抗體有一定療效，而自身T細胞表位誘導的免疫應答則會引起不可逆的免疫病理損傷，因此在設計多肽疫苗時，可選用B細胞表位而不能選擇自身T細胞表位。這種情況下可采用B+T*表位方式，比如Ramirez-Gualito等[30]將來源于Tau蛋白的針對阿爾茨海默病的B細胞表位和來源于結核分枝桿菌Ag85B的T細胞表位用四肽GPSL連接起來形成β轉角得到28肽，實驗證實該連接方法對各表位的免疫原性影響很弱。在設計針對登革病毒的多肽疫苗時，必須考慮到其特異性的抗體增強作用會導致巨噬細胞的感染加重，因此設計多肽疫苗時應避免選擇其B細胞表位[31]，另外，在分析聯合多肽表位的免疫原性時，一般將單個T、B細胞表位作為對照，或者將T+T*表位、B+T*表位作為對照，評價T+B+T*表位誘導免疫應答的效果。

4 結語

雖然針對聯合T、B細胞表位多肽疫苗設計的研究已取得一定的進展，但各種疾病抗原的多肽表位設計方法較為獨立，聯合T、B細胞表位多肽疫苗的設計研究尚缺乏較為實用的規律和標準。例如表位如何優化選擇，多肽表位之間如何優化連接等問題都有待進一步解決。同時，多肽疫苗的研制還有賴于抗原表位基本研究的進步，如優勢T、B細胞表位的鑒定，更加有效的通用Th細胞表位的篩選以及合適的佐劑與運載體的應用等，均需要更深入的研究與探討。

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[收稿2016-01-28 修回2016-03-05]

(編輯 倪 鵬)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.029

①本文受國家自然科學基金青年科學基金項目(81401297)、陜西省自然科學基礎研究計劃青年人才項目(2015JQ8295)資助。

李少華(1996年-)，男，主要從事抗感染免疫研究，E-mail:330321697@qq.com。

及指導教師：馬 櫻(1984年-)，女，博士，講師，主要從事抗感染免疫研究，E-mail：merry_bg20@163.com。

R392.3

A

1000-484X(2017)01-0136-04

②第四軍醫大學學員旅五營十七連，西安710032。