乙型肝炎病毒B和C基因型S蛋白特異性CTL表位保守性分析

陳慶新，李文姝，陳卓艷，何佳莉，汪文寰，林茂，葉菊秀

（溫州醫科大學，浙江 溫州 325035，1.微生物學與免疫學教研室；2.眼視光學院）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）在中國高度流行，根據HBV基因序列，可將世界范圍內的HBV分為A-H 8個基因型，各基因型間核苷酸序列同源性差異超過8%，我國流行的HBV基因型主要為B和C型[1]。HBV感染過程中的免疫耐受和免疫逃逸是HBV慢性感染發生的重要致病機制[2]，而HBV特異性的細胞毒性T細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）介導的細胞免疫應答，是最終清除HBV的關鍵，因此對國內流行基因型的CTL表位進行對比分析，將有助于了解HBV免疫逃逸特點，從而找到穩定特異性CTL靶點，為HBV感染后的治療奠定基礎。

本研究主要對HBV在國內流行的B和C基因型S區基因編碼蛋白HLA-A*0201限制性CTL表位進行了生物信息學篩選，CTL表位長度選擇為9個氨基酸，結合已鑒定和報道的表位及GenBank中已有的B和C基因型進行比較，尋找穩定的B和C基因型S區基因編碼蛋白HLA-A*0201限制性CTL表位，探索可以用于HBV細胞免疫治療的表位。

1 材料和方法

1.1 試劑與載體 pIRES載體、pGEM-T-HBV全基因組（HBV C基因型）重組載體由本實驗室保存，Proteinase K購自德國Merck公司。IPTG、Ampicilin、X-Gal、進口CaCl2、胰蛋白酶（1∶250）、UNIQ-5柱離心式膠回收試劑盒、Taq plus DNA Ploymerase及dNTP Mix等購自上海生工生物工程有限公司。T4 DNA連接酶購自大連TAKARA公司。LB液體培養基、LB固體培養基、CaCl2溶液購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 HBsAg基因的克隆和載體構建 根據HBV全基因組，設計一對引物，上游引物：5’-AGCTGCTAGCTCC GGAACAGTAAACCCTG-3’，含Nhe I酶切位點；下游引物：5’-GCCGATTAGGGTTCAAATGTA-3’，含Mlu I酶切位點。以pGEM-T-HBV全基因載體為模板，PCR擴增可得到長度為789 bp的HBsAg目的基因，將PCR產物用Nhe I和Mlu I雙酶切后進行純化，與同樣酶切純化后的pIRES混合，加入T4 DNA ligase置16 ℃恒溫儀連接過夜，轉化大腸桿菌DH5α。PCR和酶切鑒定為陽性的重組質粒送上?；倒綝NA測序。

1.3 候選CTL表位預測 選擇HBV B基因型（D00330）和C基因型（AB033556）的S區基因序列，采用BIMAS、NetMHC和SYFPEITHI[3]預測軟件分別預測S區基因編碼蛋白HLA-A*0201限制性CTL表位。SYFPEITHI預測得分大于21作為CTL表位選擇條件，NetMHC預測結果中選擇affinity binding level＜50 nmol/L的CTL表位，BIMAS預測得分大于25作為CTL標為選擇依據。

1.4 候選CTL表位分析 將3種預測軟件篩選出的高分CTL表位進行分析，在BIMAS、NetMHC和SYFPEITHI中的至少2個預測軟件中都具有較高的預測得分選定為候選CTL表位；通過BLAST檢索HBV蛋白庫，分析候選CTL表位在大量HBV B和C基因型中保守性；將候選表位是否在其他文獻中已經被鑒定過進行標注。

2 結果

2.1 HBsAg基因的克隆和鑒定 PCR產物核酸電泳可見大約0.8 bp的片段，與預期789 bp相符（見圖1）；重組載體pIRES-HBsAg酶切后可以得到6 100 bp的載體片段和800 bp的目的片段（見圖2），測序分析顯示與HBV S基因序列一致，說明HBsAg基因已經克隆并成功構建pIRES-HBsAg真核表達載體。

圖1 HBV S基因的PCR產物核酸電泳圖

圖2 pIRES-HBsAg重組質粒的酶切鑒定結果

2.2 預測CTL表位得分情況 根據HLA-A*0201限制性和9肽等條件，通過BIMAS、NetMHC和SYFPEITHI等方法對選擇序列分別進行分析后得到如下結果。SYFPEITH分析共得到18個評分大于21的CTL表位（見表1）。NetMHC對CTL表位的親和性分析后，根據評分和親和力共得到了14個親和性高的CTL表位（見表2）。BIMAS對S蛋白HLA-A*0201限制性CTL表位分子的解離半衰期進行評分，共預測得到20個可能存在的表位分子（見表3）。通過對表位在3種方法中的得分情況進行綜合分析對比后，最后共選擇17個表位進入后續的保守性分析。

2.3 候選CTL表位保守性分析 對預測表位進行分數比較、B和C基因型的保守性比較、是否鑒定等進行綜合分析后發現，預測表位在B和C基因型的保守性分析發現除了S205-213（SLDSWWTSL）、S261-269（ILLLCLIFL）、S257-265（FLFILLLCL）、S270-278（VLLDYQGML）和S250-258（CLRRFIIFL）等保守率能夠達到80%以上，其余表位保守性較低。已經鑒定過的表位發現，這些表位在B和C基因型中的保守性也較低，其中S215-223表位在C基因型中保守性為0%，在B基因型中則是70.2%；而S131-139和S194-202是在C基因型中保守性較高，B基因型中保守性較低，同樣在未鑒定表位（S255-263和S276-284）中也存在相同現象（見表4）。

表1 SYFPEITHI預測S區編碼蛋白HLA-A*0201限制性CTL表位

表2 NetMHCI預測S區基因編碼蛋白HLA-A*0201限制性CTL表位結果

表3 BIMAS預測S區基因編碼蛋白HLA-A*0201限制性CTL表位結果

表4 候選HLA-A*0201限制性S區基因編碼蛋白CTL表位的綜合分析

3 討論

HBV感染會導致慢性肝炎、肝硬化、肝癌等嚴重后果，而國內感染者眾多，清除慢性感染者體內HBV是一項艱巨而復雜的任務[4]。HBV特異性細胞免疫應答的建立是最終清除HBV感染的根本途徑，因此對HBV CTL表位的選擇就顯得至關重要[5]。在研究HBV表位的時候，應選擇與國內流行的B和C基因型一致的表位，否則可能會影響其在國內的臨床應用[6-8]。本研究結果顯示蛋白庫中HBV B和C基因型的S區基因編碼蛋白特異性CTL表位與已鑒定CTL表位存在較大差異，這些差異會影響細胞免疫到對HBV的識別，所以選擇保守性高的CTL表位對國內HBV感染后的免疫治療具有重要意義。

本研究成功克隆HBV S基因并構建真核表達載體，通過HBV B和C基因型的S區基因編碼蛋白的生物信息學分析，共篩選到17個CTL表位肽，其中已經鑒定過的有6個表位，其余表位均是未鑒定表位，保守性分析顯示S區基因編碼蛋白在B和C基因型中保守性不高，未鑒定的表位中有6個表位在HBV B和C基因型中保守率均超過80%，已鑒定表位在B和C基因型中保守性相對較低。這些結果顯示S區基因是B和C基因型間差異的重要區域，由于S區基因的變異，導致CTL表位的改變。HBV CTL表位保守性分析提示通過S區基因編碼蛋白表位的變異是HBV逃避機體的免疫應答，進而形成持續性感染和免疫耐受的重要機制。

研究發現不同HBV基因型感染人體后會導致不同的臨床結局，C基因型比B基因型更能引起患者的肝臟纖維化和肝癌的發生[4，9-10]。通過對S區基因編碼蛋白表位的保守性分析發現，S215-223表位在B基因型中保守率較高，而在C基因型中保守率為0，S131-1139、S194-202、S255-263和S276-284等表位在C基因型中保守率高，而在B基因型中保守率極低，說明這些表位具有型特異性，其是否與B型和C型致病性差異有關，需要通過進一步研究證實。另外，也可以將這種型特異性表位用于HBV基因型的分型鑒定[11]。

本研究克隆HBV S基因，構建真核表達載體，并對國內流行廣泛的乙型肝炎病毒B和C基因型中S區基因編碼蛋白的存在的可能表位進行了生物信息學篩選，分析了被篩選表位在B和C基因型中的保守性，共得到6個特異性CTL表位肽，它們在B和C基因型間均具有較高的保守性，為HBV表位在國內的進一步研究和應用提供數據支持。