外周血循環腫瘤細胞的研究進展

范軍振呂亞莉宋欣鐘梅王瓊朱鳳偉石懷銀(通訊作者)

100853中國人民解放軍總醫院病理科(北京)

外周血循環腫瘤細胞的研究進展

范軍振呂亞莉宋欣鐘梅王瓊朱鳳偉石懷銀(通訊作者)

100853中國人民解放軍總醫院病理科(北京)

目的：外周血循環腫瘤細胞(CTCs)在腫瘤預后評估、療效評價、腫瘤分期、復發轉移檢測方面具有重要臨床價值。CTCs臨床應用的研究主要集中于腫瘤早篩、治療方案及預后評估、基因分析、體外培養。本文針對CTCs檢測方法及臨床應用進行綜述。

循環腫瘤細胞；液體活檢分子；病理；免疫組化

目前惡性腫瘤的確診及靶向治療前的檢測均依賴于病理活檢，但病理活檢是依賴于外科手術或影像學引導的有創操作，其操作流程耗時較長，過程繁瑣，成本也相對較高。對于疑似病例、部位特殊、體積較小、腫瘤晚期等不易活檢的患者，病理活檢的應用也受到了一定的限制。多年來，人們一直致力于通過外周血檢測腫瘤標記物進行惡性腫瘤的篩查和預后判斷，但由于其敏感度和特異度并不理想，其參考意義也受到一定限制。

循環腫瘤細胞定義及性質

循環腫瘤細胞(CTCs)是指從腫瘤患者外周血中檢測到的，來源于實體腫瘤逃離宿主免疫殺傷后存活的異質性腫瘤細胞。腫瘤原發灶形成或增長過程中進入外周血循環系統的腫瘤細胞，大部分由于免疫識別機制或者細胞自身未能獲得新的生存機制而被清除，只有少量細胞由于發生尚未完全認識的變化而在外周血循環中存活下來，這類細胞即稱為CTCs。不僅如此，CTCs還有可能相互聚集，形成微小的多細胞聚集體，這類結構被稱為循環腫瘤微栓(CTM)。CTCs和CTM的存在被認為是腫瘤發生復發和轉移的重要原因和標志物[1]。

CTCs與上皮-間質轉換(EMT)：在CTCs與腫瘤轉移的研究中，EMT是一項關鍵內容，腫瘤在轉移過程中會發生上皮型向間質型的轉換，在這個過程中細胞上皮標記物(EpCAM)表達量下調，間質標記物(如Vimentin)表達量上調，從而使腫瘤細胞侵襲性增強[2]。雖然目前EMT在CTCs的研究并不充分，但已得到證實：單獨依靠上皮標記進行CTCs分離和鑒定，有可能僅捕獲那些帶有上皮標記的CTCs，而那些與腫瘤轉移相關性更高的間質型CTCs可能未被捕獲[3]。

CTCs的特性：①稀有性：每克腫瘤每日有大量腫瘤細胞脫落入血，但只有極少數存活，每105～107個有核細胞中才有一個CTCs，每10mL血液中可能僅含有幾個到幾十個CTCs[4]。②異質性：腫瘤在轉移過程中會發生EMT，在這個過程中細胞的上皮標記物表達量下調，間質標記物表達量上調，從而使腫瘤細胞侵襲性增強，蛋白表達具有不穩定性，而且不同實體瘤來源CTCs、不同患者CTCs表面抗原表達、分布也存在差異。③非典型形態：CTCs入血后隨血液快速流動，與其他細胞碰撞，受到血管壁的擠壓，受機體免疫系統以及藥物的攻擊，導致CTCs形態有別于腫瘤組織，細胞大小、形態及表型發生改變。

循環腫瘤細胞的分離富集和鑒定

CTCs的分離富集：目前CTCs的富集方法理論依據主要包括兩種：①利用CTCs和正常血液細胞在大小、形態等物理學差異以及腫瘤細胞特有的核型等特征分離和鑒定CTCs，這種以細胞大小差異為基礎的方法稱為ISET方法[5]。②以檢測CTCs特異的表面標志物為基本原理，大部分CTCs表達CK、EpCAM等上皮細胞標記，因此可以通過這些特異性標志物進行免疫識別，在此核心原理的基礎上結合納米、微流、磁珠等技術可以實現CTCs的分離和鑒定[6]。由于CTCs的異質性，臨床研究表明很多種類腫瘤患者檢測到不表達EpCAM等標記的CTCs，因此根據CTCs的表面標志物進行檢測可能遺漏了具有轉移能力的CTCs，從而降低了其富集率[7]。

CTC的鑒定：循環腫瘤細胞的鑒定方法有很多種，如免疫組化-免疫熒光、Fish、免疫熒光-Fish、抗原抗體的鑒定技術，以及目前的葉酸受體鑒定技術等。免疫熒光標記技術可以同時使用多種熒光染料對目標細胞進行標記[8]。Fish技術鑒定循環腫瘤細胞，采用基于免疫磁珠微粒原理的前處理富集方法及熒光原位雜交原理的腫瘤細胞鑒別方法，用于定量檢測惡性腫瘤患者外周血中循環腫瘤細胞[9]。免疫熒光-Fish技術是在Fish技術的基礎上，對分離的CTCs進行免疫熒光標記，從而更加準確地鑒定CTCs。當形態學特征中包含腫瘤細胞特征并顯示出顯型EPCAM+、CK-PE+、DAPI+、CD45-時，細胞被分為CTCs[10]。

循環腫瘤細胞的相關研究方向

CTCs與腫瘤早篩：目前CTCs檢測用于早篩實體腫瘤還未有足夠的臨床數據支持。目前關于CTCs用于早篩的理論依據主要來源于動物模型的研究結果，對乳腺癌小鼠模型進行研究發現，CTCs可以在原發灶形成的早期開始出現[11]。在胰腺癌小鼠模型中，實體瘤形成前存在CTCs進入血液循環。這些動物模型中的發現提示CTCs可能用于腫瘤的早期篩查。Ilie等2014年發表于PLoSOne關于慢性阻塞性肺疾病CTCs的研究便是最有代表性的一項，這項研究中168例COPD患者和77例非COPD對照樣本進行CTCs檢測，對照組中沒有CTCs檢出，而168位COPD患者中有5例檢出CTCs，后續跟蹤發現這5例檢出CTCs的患者在1～4年內均通過CT查見肺部結節，且經病理活檢診斷為早期肺癌[12]。

CTCs與治療方案及預后評估：CTCs計數是否能用于臨床治療方案的指導，也是目前的研究方向之一。Smerage等2014年報道了CTCs計數用于臨床治療方案評估的一項臨床研究，這項研究中CTCs數量仍表現為一個良好的預后指標，基線和一線化療21 d后CTCs數量較多的患者，其PFS和OS較差，而基線CTCs數量較少的患者預后較好[13]。

在轉移性難治性前列腺癌雙盲Ⅲ期臨床試驗中，CTCs數量與患者基線PSA水平、骨痛、肝臟疾病、血紅蛋白以及堿性磷酸酶水平顯著關聯，并與PSA以及RECIST的變化關聯性顯著。CTCs超過5個的患者整體總生存期顯著縮短。

CTCs與基因分析：目前CTCs在靶向治療過程中的療效監控也是一項研究熱點，靶向治療過程中CTCs檢出及CTCs群體組成的變化可能用于快速評估靶向治療過程療效的動態變化。如2012年Punnoose等發現CTCs可用于評價晚期NSCLC患者接受靶向治療的預后，同時對患者ctDNA的分析發現，ctDNA的突變檢測比CTCs更靈敏，查出的突變結果與腫瘤的突變情況相關。其ALK及EGFR突變情況、ROS1重排與腫瘤組織高度一致[14]，且靶向治療過程中CTCs檢測到的EGFR突變丟失與治療效果及復發相關。

CTCs與體外培養：以上研究主要基于CTCs的捕獲及鑒定，而通過捕獲有活性CTCs的微流控技術，使CTCs培養并進行其功能研究是另一個重要的潛在應用方向。培養CTCs獲得細胞系可以用于基因測序、藥敏實驗等一系列研究[15]。但目前CTCs培養的研究尚不夠成熟，主要面臨兩個方面的問題：①CTCs培養條件并不完善，CTCs成功培養的效率目前仍然較低；②CTCs培養依賴于捕獲的CTCs數量。這是CTCs培養在臨床應用中需要解決的關鍵問題。

小結

目前關于CTCs的研究主要可以分為兩個方向：①CTCs生物學特性的研究；②CTCs在臨床應用的研究。CTCs的生物學特性研究的主要內容包括不同類型CTCs(EMT、腫瘤干細胞特征、CTM)的生物學特征、CTCs的來源研究以及CTCs的分子分型的意義。這些方面的研究成果可以為CTCs的臨床應用提供理論依據。

對于CTCs在臨床應用的研究，其關鍵點在于CTCs富集和鑒定方法的標準性、可靠性以及高效性。目前臨床應用方面的研究結論主要是由CellSearch系統取得?？傮w而言，CTCs在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌等實體腫瘤中預后評估方面的臨床意義已經得到充分的證實，而在臨床研究的跟蹤指標、治療方案評估以及腫瘤早篩這三個方面的臨床意義尚未明確和充分證實。

[1]Hanahan D,Weinberg R A.Hallmarks of cancer:the next generation[J].Cell,2011,144 (5):646-674.

[2]Thiery J P.Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression[J].Nature ReviewsCancer,2002,2(6):442-454.

[3]Lin H K,Zheng S,Williams A J,etal.Portable filter-based microdevice for detection and characterization of circulating tumor cells[J]. Clinical Cancer Research,2010,16(20): 5011-5018.

[4]胡玉倩,謝圣高,鄭義,等.循環腫瘤細胞的富集與檢測研究進展[J].腫瘤防治研究, 2014,(7):834-838.

[5]Vona G,Sabile A,Louha M,et al.Isolation by size of epithelial tumor cells:a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulating tumor cells[J]. The American journal of pathology,2000,156 (1):57-63.

[6]Zhang Q,Liu T,Qin J.A microfluidic-based device for study of transendothelial invasion of tumor aggregates in realtime[J].Lab on a chip,2012,12(16):2837-2842.

[7]Hyun K A,Jung H I.Advances and critical concerns with the microfluidic enrichments of circulating tumor cells[J].Lab on a Chip, 2014,14(1):45-56.

[8]Takao M,Takeda K.Enumeration,characterization,and collection of intactcirculating tumor cells by cross contamination-free flow cytometry[J].Cytometry Part A,2011,79(2): 107-117.

[9]Mayer J A,Pham T,Wong K L,et al. FISH-based determination of HER2 status in circulating tumor cells isolated with the microfluidic CEETMplatform[J].Cancer genetics,2011,204(11):589-595.

[10]Sieuwerts AM,Kraan J,Bolt J,etal.Anti-epithelial cell adhesion molecule antibodies and the detection of circulating normal-like breast tumor cells[J].Journal of the National Cancer Institute,2009,101(1):61-66.

[11]Podsypanina K,Du Y CN,Jechlinger M,etal. Seeding and propagation of untransformed mousemammary cells in the lung[J].Science, 2008,321(5897):1841-1844.

[12]IlieM,Hofman V,Long-Mira E,etal.“Sentinel”circulating tumor cells allow early diagnosis of lung cancer in patients with chronic obstructive pulmonary disease[J]. PLoSOne,2014,9(10):e111597.

[13]Van Poznak C,Somerfield M R,BastRC,etal. Use of biomarkers to guide decisionson systemic therapy for women with metastatic breast cancer:American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline[J]. Journal of Clinical Oncology,2015,(61): 1459.

[14]Pailler E,Auger N,Lindsay C R,et al.High level of chromosomal instability in circulating tumor cells of ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer[J].AnnalsofOncology,2015,26(7):1408-1415.

[15]Yu M,Bardia A,Aceto N,etal.Ex vivo culture of circulatingbreast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility[J].Science,2014,345(6193):216-220.

Research progressof circulating tumor cells in peripheralblood

Fan Junzhen,Lv Yali,Song Xin,ZhongMei,WangQiong,Zhu Fengwei,ShiHuaiyin(Correspondingauthor)
DepartmentofPathology,the GeneralHospitalofthe Chinese People's Liberation Army(Beijing City)100853

Circulating tumor cells(CTCs)in peripheralblood played an important role in the evaluation of tumor prognosis,effect evaluation,tumor staging and metastasis detection.The clinical application of CTCs was mainly focused on early screening, treatmentand prognosis evaluation,gene analysis and in vitro culture.This paper reviewed the detectionmethods of CTCs and its clinicalapplication.

Circulating tumor cells;Liquid biopsymolecules;Pathology;Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.7.5