引起奶牛關節炎的牛支原體病原的分離鑒定

曹登慧

摘要：試驗通過細菌分離培養及分子生物學診斷技術對一起引起奶牛關節炎的病原進行了鑒定。結果顯示，該病原菌落形態為“油煎蛋樣”，牛支原體16S rRNA和uvrC均擴增出相應的片段，且16S rRNA和uvrC基因序列構建的系統發育樹與牛支原體在同一分枝。說明引起該奶牛關節炎的病原菌為牛支原體。

關鍵詞：牛支原體；關節炎；分離鑒定

中圖分類號：S858.23 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2016）09-0011-02

牛支原體（Mycoplasma bovis）是一種能夠引起牛發生肺炎、乳房炎、關節炎、角膜結膜炎、懷孕母牛流產、不孕、生殖道感染等的疾病[1]，在環境等應激因素的作用下還可引起多種疾病的繼發感染。1961年Hale等[2]在美國首次從患乳腺炎的牛乳中分離到該病原，1976年首次報道與牛呼吸系統疾病有關。目前，該牛支原體病原在世界范圍內廣泛流行，并對各國的養牛行業造成巨大的經濟損失，嚴重影響和制約了各國養牛業的發展[3]。1983年，我國黎濟申首次報道從乳房炎牛乳中分離到牛支原體。自2008年以來，我國部分地區從外地引進的肉牛暴發了以壞死性肺炎為主要特征的傳染性牛支原體肺炎疫情，發病率為50%～100%，病死率高達10%～50%，給我國養牛業造成了巨大的經濟損失[4]，此后重慶、內蒙、貴州、寧夏等多省報道了肉牛和奶牛發生了牛支原體病[5，6]，因此牛支原體在牛養殖過程中也成為危害性較大的病原體之一，但國內很少有關于牛支原體感染成年母牛引起關節腫大的報道。

2015年12月，寧夏某奶牛場出現成年奶牛關節腫大癥狀，患病母牛是從甘肅地區新采購的泌乳母牛，購買時均未發現其有關節腫大癥狀，于購回后一周出現四肢關節腫大現象，雖用抗生素進行治療，但未能治愈。該成年母牛除關節腫大外未表現出咳嗽、肺部聽診呈濕啰音等癥狀。為確定引起該牛關節腫大的病原體，在無菌條件下采取成年奶牛關節積液若干份進行了病原的分離培養及鑒定。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

1.1.1 病料 無菌采集的寧夏某牛場關節腫大奶牛的關節液。

1.1.2 主要試劑及設備 主要試劑：細菌基因組DNA提取試劑盒（DP209-02），瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP302-02），天根生化科技有限公司；D2500-50Omega-瓊脂糖凝膠回收試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。主要儀器：CO2培養箱、PCR擴增儀、電泳凝膠成像系統等。

1.2 方法

將關節液接種于改良的Thiaucourt's液體培養基中。置于37 ℃恒溫振蕩培養箱中培養2 d，2 d后觀察培養基的顏色，將變為黃色的培養液使用0.22 μm濾膜進行過濾，重復培養過濾液2 d后接種于牛支原體Thiaucourt's 固體篩選培養基，置于5% CO2培養箱中37 ℃條件下培養2～4 d，固體培養基由紅色變為黃色并且出現針尖大小密集的菌落，在光學顯微鏡下觀察菌落形態。

1.3 特異性PCR鑒定

1.3.1 菌體收集 吸取2 mL牛支原體液體培養物于2 mL滅菌離心管中，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，后棄上清，用滅菌濾紙片吸干離心管管壁上的上清液，向滅菌離心管中加入2.2 mL PBS（0.01 mol/L，pH 7.2）將菌體沉淀懸浮，于4 ℃ 12 000 r/min再次離心30 min后棄上清。同樣用滅菌濾紙吸干多余液體后加入250 μL PBS（0.01 mol/L，pH 7.2），轉到1.5 mL滅菌離心管中保存備用。

1.3.2 基因組DNA的提取 具體方法按試劑盒說明書中的方法進行。

1.3.3 PCR引物的合成 根據GenBank中牛支原體的全基因序列，分別設計支原體16S rRNA通用引物P1：上游引物5′-GAATTCCGAGAGTTTGATCCTGGCT-3′，下游引物：5′-AAGCTTGAGGTAATCCATCCCCACGTTC-3′；牛支原體uvrC特異性引物P2：上游引物：5′-GAATTCAATGTGTCTACTAGTCCTGG-3′，下游引物：5′-AAGCTTAGCGTCATAGATTTTTGCATA-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.4 PCR反應 25 μL PCR反應體系：模板2 μL，P1、P2引物各0.5 μL，Mix 10 μL，dd H2O 12 μL，共計25 μL。

16S rRNA引物PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸2 min，35個循環。72 ℃延伸8 min。

UvrC引物PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，50 ℃退火20 s，72 ℃延伸2 min，35個循環。72 ℃延伸8 min。

將經過擴增的DNA產物通過瓊脂糖凝膠電泳試驗進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 病牛臨床癥狀

患病奶牛主要表現為四肢關節腫大（圖1），未表現出咳嗽、肺部聽診濕啰音、體溫升高等癥狀。該牛用頭孢、青霉素、鏈霉素、卡那霉素等抗生素治療效果不明顯，并且該牛關節液渾濁。

2.2 病原的分離

將關節液接種于Thiaucourt's液體培養基置于37 ℃恒溫振蕩培養箱中培養，2 d后用0.22 μm過濾器進行過濾，繼續培養過濾液2 d后，培養基由紅色變為黃色且澄清透明，無沉淀。取10 μL液體培養液接種于固體培養基于5% CO2培養箱37 ℃培養2 d，長出針尖大小菌落，顯微鏡下呈現牛支原體典型的“油煎蛋”樣菌落（圖2、圖3）。

2.3 PCR鑒定

由圖4和圖5可知，經16S rRNA引物和uvrC引物PCR擴增關節液培養物和牛支原體陽性對照，并通過瓊脂糖凝膠電泳分析，結果發現，引起牛只關節腫大的病原菌的16S rRNA擴增序列長度約1.5 kb左右，uvrC擴增序列長度約1.6 kb，與陽性對照一致。根據PCR結果可初步鑒定該病原微生物為牛支原體。

2.4 遺傳進化分析

經測序并構建遺傳進化樹分析可知，16S rRNA序列構建的系統發育樹結果表明，GJY與已報道的牛支原體120/81菌株遺傳距離最近，自檢支持率達75%（圖6）；uvrC序列同源性比較結果顯示，GJY與GenBank中的牛支原體Egy-11-DK-14、HB0801-P150株同源性最高。構建的系統發育樹結果表明，GJY與已報道的牛支原體Egy-11-DK-14、HB0801-P150遺傳距離最近，與Egy-11-DK-14自檢支持率達86%（圖7）。根據遺傳進化樹結果最終可以確定引起此次奶牛關節炎的病原菌為牛支原體。

3 討論

牛支原體是柔膜體綱支原體目支原體科支原體屬的一員，無細胞壁，具有典型的“油煎蛋”樣菌落形態。當氣候條件、飼養環境及飼料配方發生改變時，牛體抵抗力下降，就有可能引發牛支原體病的發生。隨著我國養牛產業的快速發展，牛群的調運必然是促進規?；B殖的關鍵，然而不同地區之間的牛群調運必然會使病原菌快速傳播擴散，牛支原體傳播擴散的風險也將提高，因此應引起各級獸醫部門的重視，提高對牛支原體肺炎的認識，加強對該病的防控措施[7，8]。分析本次引起牛支原體肺炎關節腫大的主要原因是該牛場在引進牛只時牛群管理不到位及平時牛群飼養管理中存在著欠缺，在引進牛只時未進行牛支原體普查，致使帶菌牛被購進，購進的牛又由于長途運輸產生了應激，進而免疫力降低。由于目前對于牛支原體病原沒有很好的治療藥物，所以建議牛場進行牛支原體普查，制定科學合理的防治方案，降低牛支原體給規?；B殖帶來的風險，做好牛場管控，防止牛支原體在各牧場間傳染。

目前牛支原體的分離培養與分子生物學鑒定可作為該病原體的確診依據，特別是使用牛支原體uvrC特異性引物進行鑒定，可有效區分無乳支原體等病原的混淆。本試驗通過病料采集、實驗室分離鑒定，結合分子生物學鑒定，遺傳進化分析，最終確診引起該奶牛場成年母牛關節腫大的病原為牛支原體，為牛支原體引起的肺炎和關節腫大等疾病的實驗室診斷及病原的分析奠定了一定基礎。

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