草魚腸道不動桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

胡秀彩+李旭+呂愛軍

摘要：從草魚腸道中分離獲得1株細菌，編號為CAX1，進行細菌形態學觀察、理化特征、16S rDNA序列分析及藥敏試驗等研究。結果表明CAX1菌株為革蘭氏陰性短桿菌，進一步采用PCR方法擴增其16S rDNA，測序顯示其大小為 1 531 bp，序列比對表明CAX1分離株與廈門不動桿菌新種（Acinetobacter xiamenensis）16S rDNA同源性達97.1%，系統進化樹分析顯示CAX1菌株與不動桿菌親緣關系最近，自然聚類為1支；藥敏試驗結果顯示CAX1菌株對慶大霉素、阿莫西林、氨芐西林、頭孢哌酮等藥物敏感。

關鍵詞：草魚；腸道細菌；分離鑒定；藥敏試驗；系統進化樹

中圖分類號： S943.112.42 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0256-02

不動桿菌屬（Acinetobacter）菌株在自然界廣泛存在，主要分布在水體和土壤中，易在潮濕環境中生存，目前確定的不動桿菌屬至少有10多個種[1-3]，包括鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumanii）、魯菲不動桿菌（Acinetobacter lwoffi）、溶血不動桿菌（Acinetobacter haemolytius）、瓊氏不動桿菌（Acinetobacter junii）、約翰遜不動桿菌（Acinetobacter johnsonii）、醋酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus），以及新發現的廈門不動桿菌（Acinetobacter xiamenensis）、不動桿菌（Acinetobacter guillouiae）等。近年來，一般認為不動桿菌多為條件致病菌，其中鮑曼不動桿菌引起醫院內感染頻發，耐藥菌株不斷增多，因此該屬細菌被廣泛關注[4]。最近，國內學者從異育銀鯽、錦鯉等魚類體內分離到致病性鮑曼不動桿菌、瓊氏不動桿菌等[5-6]。但是，目前尚未見魚源廈門不動桿菌分離鑒定相關研究。本研究以草魚為研究對象，從其腸道中分離獲得1株不動桿菌，并進行細菌形態學、生理生化以及16S rDNA測序等分析鑒定為廈門不動桿菌，這為草魚不動桿菌的分離鑒定以及腸道微生態研究積累了科學資料。

1 材料與方法

1.1 材料

草魚購自徐州市某市場。LB培養基、細菌生化微量鑒定和藥敏試紙均購自杭州微生物制劑有限公司。細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、pMD18-T、Master Mix均購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離、鑒定、理化性質及藥敏試驗 參照沈曉靜等的方法[7]進行細菌分離純化、革蘭氏染色及生化鑒定，將純化培養后的細菌分別接種于21種生化管中，28 ℃培養 24～28 h，觀察分離細菌的生理生化反應。無菌環境下將藥敏紙片分別置于涂有均勻菌液的LB固體培養基表面，28 ℃培養16～18 h后測量抑菌圈直徑，計算平均值，確定該菌對不同藥物的敏感程度。

1.2.2 細菌總DNA提取、16S rDNA基因PCR擴增 采用細菌基因組提取試劑盒提取細菌總DNA，PCR擴增反應體系（25 μL）：DNA模板1 μL，細菌通用引物（27F：AGAGTTTGATCATGGCTCA，1492R：TACGGTTACCTTGTTACGACTT）各1 μL，Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應條件：94 ℃ 預變性2 min；94 ℃變性40 s，53 ℃復性40 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。瓊膠糖凝膠電泳進一步檢測PCR結果，PCR產物切膠回收，連接pMD18-T載體，轉化后篩選陽性克隆，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3 系統發育樹分析 將16S rDNA序列通過NCBI的Blast檢索系統進行序列同源性分析，使用 ClustalX 1.81 軟件進行多序列比對，采用MEGA 4.1軟件鄰接法（neighbor joining）構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 細菌分離

從市售草魚腸道內分離純化獲得1株細菌，編號為CAX1，革蘭氏染色觀察為陰性小桿菌，多為單個分散分布。CAX1菌株接種于LB培養基28 ℃培養24 h后，為光滑、透明、表面濕潤、邊緣整齊的圓形菌落（圖1）。

2.2 理化特征及藥敏試驗結果

對分離菌進行生化特性檢測，結果（表1）表明，CAX1菌株為葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖檢測試驗呈陽性，精氨酸雙水解、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、葡萄糖酸鹽、肌醇、麥芽糖、甘露醇、乳糖、蜜二糖、鼠李糖、硫化氫、山梨醇、木糖醇、木糖檢測試驗呈陰性。藥敏試驗結果顯示CAX1菌株對慶大霉素、阿莫西林、頭孢哌酮、復方新諾明等9種抗生素敏感，對諾氟沙星、頭孢孟多、頭孢噻吩、先鋒霉素Ⅳ、氯霉素、四環素等抗生素不敏感。

2.3 16S rDNA基因測序及系統發育樹分析

以CAX1細菌基因組DNA為模板，采用PCR方法擴增CAX1菌株的16S rDNA序列，電泳檢測發現約在 1 500 bp 處有明顯目的條帶；進一步對16S rDNA測序表明目的片段大小為1 531 bp。將16S rDNA通過Blast檢索系統進行序列比對分析，結果表明CAX1菌株與廈門不動桿菌新種序列同源性為97.1%。系統進化樹分析結果顯示CAX1菌株與不動桿菌的親緣關系最近，自然聚類為1支（圖2）。

3 討論

不動桿菌屬是一類非發酵革蘭氏陰性桿菌，在水體和土壤中分布廣泛。研究表明不動桿菌是一種條件致病菌，一般認為毒力較低，在機體抵抗力下降或免疫功能受損時易出現機會感染[6-8]。鮑曼不動桿菌是醫院感染的重要病原菌之一。劉子驥等認為洛菲不動桿菌與呼吸道感染有關[3]。明德松等研究報道魯氏不動桿菌對β-內酰胺類藥物普遍耐藥，對氨基糖苷類、氟喹諾酮類、磺胺類、四環素類等敏感[2]。黃林等研究發現不動桿菌能引起肉質腐敗，主要利用氨基酸，致腐能力較低[9]。在魚類中，目前對不動桿菌研究報道主要有鮑曼不動桿菌、瓊氏不動桿菌和洛菲不動桿菌[10-11]。陳翠珍等從錦鯉體內分離出瓊氏不動桿菌[5]。毛芝娟等分離獲得瓊氏不動桿菌，引起患病史氏鱘癥狀為體表褪色、肛門紅腫、腹腔腫大伴有大量血性腹水[10]。陸文浩等從異育銀鯽分離鑒定出鮑曼不動桿菌，患病癥狀為腹腔積水、咽腔組織充血和鰓組織發炎等[6]。張涵等研究表明三角帆蚌、銀鯽、青魚、鳙等腸道優勢菌群均有不動桿菌屬，推測不動桿菌為淡水魚類腸道優勢菌[11]。目前尚無研究表明廈門不動桿菌對魚類具有致病性[12]。本研究從草魚腸道分離獲得CAX1菌株，采用細菌形態學觀察、理化特征、16S rDNA序列以及系統發育樹分析等方法，最終鑒定為廈門不動桿菌，在魚類腸道中尚屬首次報道，有待于進一步深入研究。藥敏試驗結果表明，CAX1菌株對慶大霉素、阿莫西林、氨芐西林、頭孢哌酮、復方新諾明等抗生素敏感，以上研究為魚類不動桿菌的分離鑒定以及腸道微生態研究提供科學參考。

參考文獻：

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[5]陳翠珍，張曉君，房 海，等. 錦鯉中瓊氏不動桿菌的分離與鑒定[J]. 水生態學雜志，2009，2（1）：86-90.

[6]陸文浩，陳 輝，王習達，等. 異育銀鯽致病性鮑曼不動桿菌的鑒定和系統發育分析[J]. 中國獸醫科學，2009，39（4）：303-309.

[7]沈曉靜，胡秀彩，蘭 云，等 .錦鯉熒光假單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗[J]. 水產科學，2014，33（7）：443-446.

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[9]黃 林，陳全勝，張燕華，等. 冷卻豬肉優勢腐敗菌分離鑒定及致腐能力測定[J]. 食品科學，2013，34（1）：205-209.

[10]毛芝娟，毛甬州，汪建萍. 兩株魚源瓊氏不動桿菌的分離、鑒定和耐藥特性分析[J]. 水產學報，2013，37（10）：1572-1576.

[11]張 涵，周 濤，王 巖. 綜合養殖池塘中三角帆蚌和魚類腸道細菌的組成[J]. 水生生物學報，2013，37（5）：824-835.

[12]劉 君，宋曉玲，陳志鑫. 益生菌對水產動物的作用研究進展[J]. 動物醫學進展，2009，30（9）：78-81.