黃曲霉毒素B1生物降解菌的快速篩選及鑒定

閔勇+徐琳+劉曉艷+高天雨+王開梅+楊自文

摘要：通過48孔板微培養的方法對336株芽孢桿菌菌株進行黃曲霉毒素B1生物降解菌的快速篩選，獲得14株能在以香豆素作為惟一碳氮源的培養基中生長的芽孢桿菌菌株。在投料濃度為100 μg/kg條件下，對這14株芽孢桿菌進行復篩，獲得1株黃曲霉毒素B1降解率為83.20%的芽孢桿菌菌株。通過16S rDNA序列比對分析，初步確定這株芽孢桿菌為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。

關鍵詞：黃曲霉毒素B1；生物降解；香豆素；巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）

中圖分類號：S852.66 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）20-5249-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.021

Abstract： Rapid screening of Aflatoxin B1 biodegration strains was carried out through microcultivation in 48 rectangular well deep well plates. 336 Bacillus strains were screened and 12 strains could grow in the media using coumarin as the sole source of energy and carbon. The 14 strains were re-screened in the media containing 100 μg/kg Aflatoxion B1. One strain which the biodegration ratio of Aflatoxin B1 reached 83.2% was obtained. After gene sequencing and sequence alignment of 16S rDNA，the strain was preliminarily identified as Bacillus megaterium.

Key words： Aflatoxin B1； biodegration； coumarin； Bacillus megaterium

黃曲霉毒素（Aflatoxin AFT）是由黃曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）和特異曲霉（Aspergillus nomius）等多種真菌在生長過程中產生并分泌的一類結構相似的次級代謝產物，主要包括AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2、AFB2a、AFG2a、AFBM2a和AFGM2a等，其中黃曲霉毒素B1（AFB1）分布范圍最廣、化學性質最穩定，且是黃曲霉毒素中毒性最強的，具有很強的致癌性、致突變性、致畸性和強免疫抑制性等作用[1]。黃曲霉毒素常存在于各種動物飼料和人類食品中。用污染的飼料飼養畜禽，會導致肉、乳及其制品的污染，人類食用被污染的食品會導致急性中毒，引起肝臟壞死出血，慢性中毒可引起肝癌，嚴重的可造成死亡[2，3]。因此，在實踐中采取必要可行的措施減少和消除AFB1帶來的危害刻不容緩。

AFB1的傳統脫毒方法有堿處理法、氧化處理法、高溫法、吸附劑法和抗氧化劑法等。但是這些方法具有破壞營養、去毒不徹底和成本高等缺陷，實際的防控和脫毒效果并不理想[1，4]。目前，AFB1的生物脫毒技術越來越成為研究的熱點，該技術主要利用微生物的代謝產物，如酶類，分解破壞AFB1產生低毒或無毒的降解產物。微生物及生物酶脫毒因具有解毒效率高、特異性強、對飼料和環境無污染等特點和優勢而備受研究者重視。已發現多種微生物，包括細菌、放線菌、酵母菌、霉菌和藻類等均有降解AFB1的能力。

本研究以香豆素為惟一碳氮源，通過48孔板培養的方式對實驗室保存的336株芽孢桿菌進行初篩，將長勢良好的菌株與AFB1在48孔板中共培養，然后采用ELISA試劑盒測定AFB1降解率的方法進行復篩，篩選到了2株高效降解AFB1的菌株，并對其中一株菌株進行了16S rDNA鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗菌株：湖北省生物農藥工程研究中心從土樣中分離并保存的336株芽孢桿菌。

種子培養基LB配制方法參照文獻[5]；初篩培養基：KH2PO4 0.5 g、NH4NO3 2.0 g、CaCO3 2.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4 20 mg，溶于1 000 mL去離子水中（pH 7.0），121 ℃滅菌20 min，滅菌的無機鹽培養基與過濾除菌的0.2%香豆素水溶液等體積混合，即為初篩培養基；復篩培養基：酵母粉3.0 g、蛋白胨5.0 g、葡萄糖6.0 g、NaCl 10.0 g，溶于1 000 mL去離子水中（pH 7.0）。

1.2 方法

1.2.1 芽孢桿菌活化 在48孔板中每孔各加入1 mL LB培養基，滅菌后接種芽孢桿菌菌株，將48孔板置于96孔板混勻儀上于37 ℃、200～250 r/min條件下振蕩培養48 h。

1.2.2 AFB1生物降解菌的初篩 在滅菌后的48孔板中每孔加入800 μL的香豆素初篩培養基，吸取200 μL活化好的芽孢桿菌菌液并將其轉移至初篩培養基中，于30 ℃、200～250 r/min條件下振蕩培養72 h，挑取生長良好的菌落，轉接于新鮮的香豆素初篩培養基中繼續培養，如此重復3～4次。

1.2.3 AFB1生物降解菌的復篩 為避免細胞在原環境中的碳氮源干擾，對能在以香豆素為惟一碳氮源培養基中生長的菌株進行復篩。在48孔板中每孔加入800 μL復篩培養基，滅菌后接種需要進行復篩的芽孢桿菌菌株。將48孔板置于96孔板混勻儀上，于30 ℃、200～250 r/min條件下振蕩培養24 h，然后每孔加入200 μL AFB1（500 μg/kg，終濃度為100 μg/kg），于30 ℃繼續振蕩培養72 h。

1.2.4 AFB1提取和競爭性酶聯免疫方法（ELISA）測定 提取方法參考文獻[6]，AFB1含量按間接競爭ELISA方法操作，具體見百奧森科技公司產品說明書，待測空白對照孔的AFB1終濃度為2 μg/kg。450 nm酶標儀讀數，對照標準曲線計算處理的AFB1含量及降解率。計算公式如下：

式中，x1代表空白對照AFB1含量（2 μg/kg）；x2代表處理的AFB1的含量；y代表降解率。

1.2.5 菌株的鑒定 ①形態觀察。菌株接種于LB培養基平板上，37 ℃培養48 h，觀察菌落形態、色澤，顯微鏡觀察細胞形狀等；②細菌16S rDNA序列測定。A.按照參考文獻[5]中方法提取細菌基因組DNA；B.16S rRNA基因序列的PCR，引物（27F 5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′；l492R 5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）；C.PCR擴增產物送上海生工生物工程有限公司純化、測序；D.測序結果在NCBI使用Blast比對，從GenBank數據庫中獲得與菌株16S rDNA同源的公認標準序列數據。

2 結果與分析

2.1 AFB1降解菌株的初篩

通過48孔板微培養，對336株芽孢桿菌，共計7板菌株進行了初篩，經過3次轉接，獲得14株能在以香豆素作為惟一碳氮源的培養基中生長的芽孢桿菌菌株（表1）。

2.2 AFB1標準曲線制作

將系列AFB1標準溶液（0、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 μg/kg）測得的吸光度OD值，測得不同AFB1含量下對應的吸光度A450，如表2所示。

以橫坐標為標準溶液濃度的常用對數值（lgC），縱坐標為各標準孔OD值與0 μg/kg標準孔OD值的比值[B樣品/B（0 μg/kg）]，繪制散點圖并添加線性趨勢線，得到AFB1標準曲線見圖1。由圖1可知，AFB1含量與各標準孔OD值與0 μg/kg標準孔OD值的比值[B樣品/B（0 μg/kg）]的關系式，即線性回歸方程y=-29.503x+84.158，R2=0.995 9，說明變量y的變異中有99.59%是由變量x引起的，擬合優度較好，故可根據此方程來計算AFB1的含量。

2.3 AFB1降解菌株的復篩

篩選出的14株芽孢桿菌菌株降解AFB1能力的結果見表3。由表3可知，14株芽孢桿菌均具有降解AFB1的能力，根據空白對照AFB1含量為2 μg/kg，計算各處理降解率。其中，CC6菌株和EF4菌株AFB1降解率分別達83.20%和79.10%，明顯優于其他菌株。

2.4 菌株分子鑒定

將CC6芽孢桿菌菌株16S rDNA基因序列在NCBI中經Blast比對，從GenBank數據庫中獲得有關種的公認標準序列數據進行系統發育分析（圖2）。由圖2可知，CC6菌株與巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）位于同一個分支，同源性達100%。

3 小結與討論

本研究通過48孔長方形深孔板微生物培養的方法，對實驗室保存的336株芽孢桿菌菌株進行了AFB1生物降解菌的快速篩選，獲得14株能在以香豆素作為惟一碳氮源的培養基上生長的菌株。通過添加AFB1作為底物，對這14株芽孢桿菌進行復篩，在AFB1投料濃度為100 μg/kg的條件下，篩選得到兩株降解率分別為83.20%和79.10%的菌株。本研究再次驗證使用香豆素作為惟一碳氮源篩選AFB1生物降解菌株是一種簡潔、快速和安全的方法[6]。經過16S rDNA序列測定和GenBank數據庫序列比對分析，初步確定降解效率最高的芽孢桿菌CC6為巨大芽孢桿菌。相比其他研究中篩選得到的真菌和假單胞菌等菌株，芽孢桿菌在實際應用方面具有更大的優勢。

本研究采用了酶聯免疫法（ELISA）檢測待測樣品中AFB1的濃度?；诳乖贵w特異性反應建立起來的酶聯免疫吸附分析法，具有特異性強、分析時間短的特點，而且其靈敏度與薄層層析法或高效液相色譜法相當或更高，發酵液提取均可在48孔板中完成，操作方便，提取后即可直接測定，不需要凈化過程，一次可測定大量樣本。

與國內其他AFB1生物降解菌篩選的研究相比，在菌株的培養方面首次提出了48孔長方形深孔板培養的方法。48孔長方形深孔板每孔的體積為5 mL，選擇的裝量為1 mL，與常用的96孔正方形深孔板相比，48孔板裝量更大，振蕩培養時更容易形成湍流，可以保證菌株生長過程獲得充足的氧氣，此時菌體生長和產物合成的變化趨勢均與搖瓶培養過程非常相似。通過48孔板培養的方式，可以明顯提高初篩與復篩的效率，培養基消耗也少，具有環保、高效、便捷的優點。

參考文獻：

[1] 王 玉，陳現偉.生物降解花生粕中黃曲霉毒素B1的研究[J].飼料研究，2012（1）：80-81.

[2] 葉雪珠，王小驪，趙燕申，等.黃曲霉毒素B1檢測方法的分析[J].食品與發酵工業，2003，29（10）：90-92.

[3] 孫豐芹，金青哲，王興國，等.黃曲霉毒素B1的生物脫毒研究進展[J].糧油食品科技，2011，19（1）：39-41.

[4] GALVANO F，PIVA A，RITIENI A，et al. Dietary strategies to counteract the effects of mycotoxins：A review[J]. Journal of Food Protection，2001，64（1）：120-131.

[5] 薩姆布魯克 J，拉賽爾D W.分子克隆手冊[M].黃培堂，王嘉璽，朱厚礎，等.譯.第3版.北京：科學出版社，2004.

[6] 李俊霞，梁志宏，關 舒，等.黃曲霉毒素B1降解菌株的篩選及鑒定[J].中國農業科學，2008，41（5）：1459-1463.