DNA測序技術概述

付春鵬

(山東省濰坊科技學院 262700)

基因是生命遺傳的基本單位。由數以億計的堿基對組成的基因組，蘊藏了生命體遺傳信息的奧秘。對核酸序列進行測序是正確解讀這部“天書”的基礎，也是最為關鍵的一步。迄今，測序技術共經歷了四代變革。20 世紀 70 年代出現了第一代經典的Sanger測序技術，人類基因組計劃的實施推動了邊合成邊測序的第二代測序技術的誕生及發展，近幾年分別以單分子和納米孔測序為標志的第三和第四代測序技術應運而生。其中第二、第三和第四代測序技術統稱為下一代測序(next generation sequencing，NGS)技術。本文概述了這些測序技術的基本原理及特點。

1 第一代測序技術

早在1954年，Whitfeld就已經報道使用層析法測定了多聚核糖核苷酸的序列。第一代測序技術的標志是Sanger 于1977 年發明的 DNA 雙脫氧核苷酸末端終止測序法，以及Maxam和Gilbert 于同年發明的DNA化學降解測序法[1]。其中，Sanger法的核心原理是：由于ddNTP的2′和3′都不含羥基，在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA合成反應。在4個DNA合成反應體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標記的ddNTP(分別為：ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP)，通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列[2]。Sanger 測序技術操作快速、簡單，因此被廣泛應用。20世紀80年代末，熒光標記技術憑借著更加安全簡便的特性，逐步取代同位素標記技術，由此也誕生了自動化測序技術。由于可以用不同熒光標記4種ddNTP，使得最后產物的電泳分離過程可以在一個泳道內實現，用激光對ddNTP上的熒光標記進行激發，然后檢測不同波長的信號，通過計算機處理信號后即可獲得堿基序列，很好地解決了原技術中不同泳道遷移率存在差異的問題。自動化儀測序大大提高了測序效率，如ABI 3730 和 Amersham MegaBACE 測序儀分別可以在一次運行中分析 96 個或 384 個樣本。第一代測序儀在人類基因組計劃 DNA 測序的后期階段起到了關鍵的作用，使人類基因組計劃比原計劃提前兩年完成。但第一代測序技術存在成本高、通量低、耗時長的缺點，嚴重影響了其大規模應用[3]。

2 第二代測序技術

目前最具代表性的第二代測序平臺包括：瑞士羅氏公司(Roche)的 454測序儀、美國 Illumina公司的Solexa基因組測序儀、美國 ABI 公司的SOLiD測序儀等。第二代測序技術的原理是邊合成邊測序，即依照第一代 Sanger 測序技術的原理，通過測序儀器捕捉新摻入的末端熒光標記來確定DNA 序列組成[4]。

Solexa 測序的核心技術是 DNA 簇和可逆終止化學反應。測序前先將模板樣品DNA片段打碎形成100～200 bp的片段，然后在這些片段兩端加上特定的測序接頭。而Solexa高通量測序芯片表面附著一層單鏈引物，兩端連有接頭的單鏈 DNA 片段通過與芯片表面的引物堿基互補結合，經PCR擴增成為雙鏈。至此DNA 的一端就被錨定在測序芯片上，而另一端則隨機和附近的引物互補結合，從而也被固定住，形成“橋”式結構。 這樣經過反復 30 輪擴增循環后，每個DNA片段得到約 1 000 倍擴增，形成單克隆 DNA 簇。然后摻入經過改造的 DNA 聚合酶和帶有 4 種熒光標記的dNTP。 這些dNTP就是“可逆終止子”，其3′羥基端帶有可化學切割的部分，每個循環只允許摻入1個堿基，用激光掃描測序芯片表面，讀取聚合上去的相關核苷酸種類。隨后將這些核苷酸化學切割，恢復3′端黏性，繼續聚合下一個核苷酸。如此循環，直至每條模板序列都被聚合成雙鏈。此過程中帶有熒光標記的 dNTP能夠釋放出相應的熒光，測序儀據此捕捉熒光信號，之后計算機可以將熒光信號轉化為不同顏色的測序峰圖，便可得知測序樣品的DNA序列。

較第一代測序技術而言，第二代測序技術的測量通量顯著提高，是目前市場上主流的測序技術。但邊合成邊測序的原理也為其帶來相應不足之處，測序讀長較短和需要模板擴增是兩個主要的弊端所在。第二代測序的讀長一般在700 bp左右，為后續的序列拼接、組裝及注釋等生物信息學分析帶來了較大困難；由于PCR反應的靈敏性，導致擴增前后得到的 DNA 分子片段的數目有較大偏差，因此在分析基因表達方面存在較大的弊端[5]。在此基礎上，無需擴增、讀長更長的第三代測序技術便應運而生。

3 第三代測序技術

第三代測序技術基于單分子讀取技術，不需要PCR擴增，具有巨大的應用前景?，F有的第三代測序平臺包括美國 Helicos Bioscience 公司的HeliScope遺傳分析系統和Pacific Biosciences公司的單分子實時測序系統(SMRT)。兩者均繼承了第二代測序技術的邊合成邊測序的原理，其中SMRT系統是基于零級波導(zero-mode waveguide, ZMW)的測序技術。ZMW是一種直徑50～100 nm、深約100 nm的孔狀納米光電結構，當光線進入后呈指數衰減，僅靠近基底的部分被照亮。DNA聚合酶被固定在ZMW底部，加入模版、引物和4色熒光標記的dNTP后進行DNA合成，只有參加反應的dNTP 才能停留在ZMW底部，從而使dNTP的熒光信號被識別[6]。

第三代測序技術是計算機學、生物學、化學等多個學科領域研究相結合的結晶，功能非常強大。其顯著特點是單分子測序，即不經 PCR，可直接進行邊合成邊測序。這不僅簡化了樣品處理過程，避免了擴增可能引入的錯配，而且不受A、T、G、C 這4種堿基含量的影響，因此第三代測序技術能直接對RNA和甲基化DNA序列進行測序。

4 第四代測序技術

第二、三代測序技術均是基于光信號的測序技術，都需要昂貴的光學監測系統，并依賴 DNA 聚合酶讀取堿基序列，大大地增加了測序的成本。因此開發不使用生物化學試劑，直接讀取 DNA 序列信息的新型測序方法，就成為第四代測序技術的主要思想[7]。其中的代表當屬納米孔測序，如英國Oxford Nanopore Technologies公司所開發的納米孔測序，是基于電信號的測序技術。它利用鑲嵌于脂質雙分子層中的經過基因工程改造過的α-溶血素蛋白作為納米孔道，孔內共價結合有分子接頭。由于A、T、G、C這4 種堿基存在電荷差異，當DNA堿基通過納米孔時，從而短暫地影響流過納米孔的電流強度(4種堿基所影響的電流變化幅度各不相同)，靈敏的電子設備檢測到這些變化從而鑒定所通過的堿基[4]。

雖然納米孔測序的優點十分明顯，與前幾代技術相比在成本、速度方面有著很大優勢。但是目前還處在起步階段，在關鍵環節(如納米孔的制造和 DNA 分子通過納米孔的速度控制方面)還有待改善。

5 展望

縱觀基因組測序技術的發展歷程可以看出，從第一代到第四代測序技術無一例外地均以提高測序通量與讀長、降低測序成本、簡化測序步驟為目標[8]。目前全基因組測序的費用仍舊高昂，動輒幾百萬元的測序費用絕非一般實驗室所能承擔。千元基因組甚至百元基因組測序一直是科學家追求的目標。另外，測序技術也決不僅僅涉及生物學問題，它綜合了物理學、光學、電學和材料學等多種學科的知識，相信隨著科學技術的發展，符合上述要求的新一代的測序儀將會出現。屆時，人們對自身各個生化過程和疾病發生的分子機制等重大問題將會有更深刻細致的了解；對其他物種的生長發育、代謝調控、適應環境和生殖遺傳等各種生物學過程將會有全新的認識。