萍鄉地區RhD陰性人群基因多態性分析

巫文勛+王長奇+陽福桂

Rh血型系統是紅細胞血型系統中最為復雜的血型系統之一，具有復雜的遺傳多態性，其臨床意義僅此于ABO血型系統。Rh血型系統目前已發現49種抗原，以C、e、D、E、e這5種抗原在臨床上最為重要，尤其是D抗原，它是除ABO血型系統外最強的紅細胞抗原，具有極強的免疫原性，是造成遲發性溶血性輸血反應最常見的原因[1]。因此，鑒定RhD抗原表型被列為臨床輸血檢測常規項目[1]。編碼Rh血型抗原為2個高度同源性的基因：RhD基因和RhCE基因。RhD編碼D抗原，RhCE編碼CcEe抗原。近年來，有些研究發現一些血清學初篩陰性的個體經進一步檢測，發現一部分人有D抗原的存在。因此，為了解萍鄉地區Rh陰性人群基因多態性狀態，經序列特異性引物聚合酶鏈反應（PCR-SSP）方法進行基因學檢測，比較血清學結果與基因學結果的異同。

1資料與方法

1.1一般資料 收集我院2011年5月～2015年1月住院及門診患者2035例標本進行了RhD抗原檢測，RhD陰抗原性率為0.88%[2]，對130例RhD陰性標本進行了檢測，其中男性60例，女70例，年齡20～75歲。標本為采用EDTA抗凝的全血3 ml。

1.2儀器與試劑 美國ABI 9700 PCR擴增儀，Thermo離心機。Alphalmager凝膠成像系統，Tanon EPS 300電泳儀，紫外分光光度計，日本富士DNA提取試劑盒，天津秀鵬生物技術有限公司的RhD基因檢測試劑盒，江陰力博醫藥生物技術有限公司的RhD血型定型試劑。

1.3方法

1.3.1 RhD血型血清學鑒定 將血樣混勻洗滌3次，配成5%紅細胞懸液，取1滴加入試管中，再向試管中加入2滴IgG的抗D試劑，37℃孵育30 min。然后用生理鹽水反復洗滌3次，棄上清液，再加入廣譜抗人球蛋白試劑，1000 r/min離心1min，觀察結果。有凝集者為RhD陽性，無凝集者為RhD陰性。

1.3.2 RhD血型基因學檢測

1.3.2.1基因組DNA提取 采用日本富士DNA提取試劑盒提取基因組DNA，嚴格按說明書操作，紫外分光光度計檢測OD26010D280，以確定DNA濃度及純度，將提取好的DNA置于-20℃凍存備用。

1.3.2.2 PCR-SSP 采用天津秀鵬生物技術有限公司的RhD基因檢測試劑盒，擴增參數為96℃ 2 min，1個循環；96℃20 s 68℃ 1 min，5個循環；96℃ 20 s 65℃ 50 s 72℃ 45 s，18個循環；72℃ 5 min，1個循環；4℃保存。

1.3.2.3電泳及結果判讀 將上述擴增產物5～10 ul轉移到2.5%瓊脂糖凝膠孔中，140～150V電泳，10 min后于Alphaimager凝膠成像系統下觀察結果。865 bp為內參帶，另一條為特異性擴增帶，有特異性擴增帶判斷為陽性，無特異性擴增帶判斷陰性。

2結果

130例RhD陰性標本中，經PCR-SSP方法檢測，10例1227DEL型，119例RhD-CE（2-9）-D型，1例弱D15型。

3討論

Rh血型基因位于人類第1號染色體斷臂34.3～36.1區域。由RhD基因和RhCE基因緊密串聯排列組成。RhD基因和RhCE基因高度同源（93.8%）均有10個外顯子和9個內含子，長度分別為57932 bp和58575 bp，均編碼417個氨基酸。兩者的第8個外顯子完全相同，差異較大的是外顯子3、4.5、7、9和內含子。

RhD抗原表型除了正常的D陽性和陰性表型外還存在多種D變異表型。這種RhD變異體的形成涉及復雜的分子生物學變化，主要為RhD和RhCE等位基因發生融合、細胞外環錯義突變，外顯子缺失和等為基因被錯換等。D變異體主要包括弱D（weakD）、部分D（partialD）和DEL型。弱D抗原表達完整但是強度減弱，由基因編碼區堿基突變造成。中國人群中最為常見的是弱D15。此外，亞洲人群中還分布弱D1型、弱D24型、弱D6型。弱D12型和弱D17型等。部分D抗原表達不完整，其質量發生變異，與某些抗D試劑不發生凝集反應。中國人群中弱D以RhD-（2-9）-D2等為基因為主。DEL表型比例較高。各種族人群DEL表型的分子機制也不盡一致。中國人DEL分子機制主要有外顯子9缺失和RhD1227A兩種。

本研究通過對130例Rh陰性標本同時進行血清學檢測結果均為Rh陰性，但基因學結果卻有一定的差異，其中檢出10例1227DEL型，119例RhD-CE（2-9）-D型，1例弱D15型.。由此可見，血清學檢測Rh血型的方法快速簡便，但確實存在一定的漏檢率。為了避免在血清學上RhD變異體被誤定為RhD陰性，采用DNA分型技術來鑒定這些D變異體變得越來越重要。比如血清學鑒定為RhD陰性，但基因型確為Rh陽性的血液，當輸血時，輸注給Rh陰性的個體，就會刺激機體產生RhD抗體，當混著再次輸注Rh陰性血液時，就會出現輸血反應。對于RhD陰性女性患者，輸注這種血液，懷孕后發生新生兒溶血病的風險也隨之增大。

綜上所述，對血清學檢測的RhD陰性標本進行RhD基因型檢測勢在必行，在不久的將來，相信隨著科研和技術手段的進步，RhD基因分型方法將不斷完善，對溶血性輸血反應和新生兒溶血病等輸血相關疾病的預防定會有長足的發展[1-3]。

參考文獻：

[1]劉純，劉偉.天津地區RHD陰性人群基因多態性分析[J].廣東醫學，2012，10，33（20）：3088.

[2]歐陽福桂，劉芳，王長奇.3種RH血型抗原檢測在輸血中的應[J].江西醫藥，2012，2，47（2）：177.

[3]邵超鵬.RHD研究進展和中國人RHD研究現在分析[J].中國輸血雜志，2003，16（6）：354-357.編輯/丁一