星點設計—效應面法優化姜黃素提取工藝

謝順嵐　吳方建

[摘要] 目的 優選姜黃素提取工藝。 方法 以超聲波法提取，在乙腈∶0.5%冰醋酸=50∶50，流速1.0 mL/min，柱溫35℃，檢測波長422 nm的高效液相色譜條件下測量姜黃素含量，再應用星點設計-效應面法對工藝進行考察。結果 最優提取工藝：乙醇濃度70.89%、提取時間49.87 min、液固比15.07∶1，此條件下姜黃素最高得率為3.732%，實際值與理論值RSD為0.53%。 結論 該優選工藝預測性良好，能夠為姜黃素進一步的開發利用提供試驗基礎。

[關鍵詞] 姜黃素；星點設計；高效液相色譜法；提取工藝

[中圖分類號] R284.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）11（c）-0125-04

Optimization of extraction progress for curcumin by Central Composite Design-Response Surface Methodology

XIE Shunlan WU Fangjian▲

Department of Pharmacy， Yangtze River Shipping General Hospital， Hubei Province， Wuhan 430010， China

[Abstract] Objective To optimize extraction process for curcumin. Methods After exteracted by ultrasound-assisted extraction， the content of curcumin was measured by HPLC with acetonitrile： 0.5% glacial acetic acid = 50∶50， the flow rate was 1.0 mL/min， the column temperature was 35℃ and the detection wavelength was 422 nm. The process was then investigated by Central Composite Design-Response Surface Methodology. Results On the condition of 70.89% ethanol concentration， 15.07：01 fold solvent， 49.87 min each time， the highest yield was 3.732%，the RSD between observed and predicted values was 0.53%. Conclusion The curcumin optimum model can be basis for the further development and utilization with it high predictability.

[Key words] Curcumin ； Central composition design ； HPLC； Extraction progress

姜科植物姜黃（Curcuma longa L.），為多年生宿根草本植物，其根莖發達，成叢，多分支；根粗壯，末端膨大呈塊根。姜黃有特異氣香，性燥溫，味苦、辛，具有破血行氣、通經止痛、祛風痹痛的作用[1]。其主要有效成分姜黃素是國際公認的天然色素和香料[2]。研究表明，姜黃素具有廣譜藥理學活性，如神經保護、抗癌[3]、抗氧化[4-6]、抗菌、抗炎[7]、抗病毒，對心腦血管疾病、自身免疫病[8]、呼吸系統疾病、糖尿病、風濕[9]、肝臟疾病[10]都有治療作用，且安全性好。臨床實驗發現，即使連續3個月每日口服姜黃素12 g，個體耐受性依然良好[11]。

純凈的姜黃色素為橙黃色結晶粉末，不溶于水，易溶于有機溶劑，對光敏感[12]，不耐熱，易降解，堿性條件下易分解[13]。本文基于姜黃素的理化特性采用超聲波輔助提取法進行提取。超聲波是一種彈性機械振動波，它破壞藥材細胞，使溶劑更易擴散到細胞中，從而加速了藥材活性成分的溶解[14]，提高了活性成分浸出率。星點設計是效應曲面中最常見的二階設計[15]，由二水平析因設計加軸點和中心點構成，是一種新型實驗設計方法，在藥學領域的應用已比較成熟，具有精度高、預測性好等特點[16]。本文應用星點設計-效應面法優選提取工藝，旨在為姜黃素成分的提取優化提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

SK5200H型超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司），CPA225D型分析天平（Sartorius公司），TYS-100型高速多功能粉碎機（浙江省永康市紅太陽機電有限公司），臺式離心機（武漢赤城生物技術有限公司），SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司），島津SPD-20A液相色譜儀（日本島津公司），Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（美國Agilent公司），L6C-1025M柱溫箱（荊州市津?；た萍加邢薰荆?。

1.2 試劑

姜黃飲片（湖北金貴中藥飲片有限公司，產地廣東，生產批號：130202），姜黃素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110823-201004），甲醇、乙腈（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司），其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 姜黃素含量的測定

2.1.1 色譜條件

Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相組分A：乙腈；B：0.5%冰醋酸；A∶B=50∶50；柱溫為35℃；流速為1.0 mL/min，檢測波長為422 nm，進樣量20 μL。在此條件下，姜黃素對照品以及姜黃素供試品的色譜圖見圖1。

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取姜黃素對照品5.0 mg，置于25 mL棕色容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到姜黃素對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

取姜黃飲片，50℃烘箱干燥，粉碎機粉碎后過40目篩（直徑≤0.45 mm）。準確稱取姜黃粉末200 mg，加入70%乙醇3 mL，超聲50 min，重復提取3次，合并提取液，離心分離取上清液。吸取0.5 mL濾液，用甲醇定容至5 mL棕色容量瓶混勻，得到供試品溶液。

2.1.4 標準曲線的繪制

精密吸取姜黃素對照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度混勻。取20 μL溶液過0.22 μm濾膜后按“2.1.1”中色譜條件進樣3次，記錄峰面積。以姜黃素對照品溶液濃度（C，μg/mL）為橫坐標x，平均峰面積（A）為縱坐標y標繪制姜黃素標準曲線，線性回歸方程為y=186 347x-41 625，相關系數r=0.9998，在0.56～7.28 μg/mL濃度范圍內，峰面積與濃度線性關系良好。

2.1.5 方法學考察

2.1.5.1 精密度試驗 精密吸取對照品溶液20 μL連續進樣10次，姜黃素峰面積RSD為1.18%，表明試驗儀器精密度良好。

2.1.5.2 穩定性試驗 取同一供試品溶液，置于室溫環境中，分別于0、1、2、4、6、8、12 h進樣測定，計算得到姜黃素峰面積RSD為0.72%，說明該供試品在12 h內穩定。

2.1.5.3 重復性試驗 取同一供試品溶液6份，按照“2.1.1”中的色譜條件進樣，結果姜黃素峰面積RSD為1.25%，說明該試驗方法重復性良好。

2.1.5.4 加樣回收率試驗 精密量取已知姜黃素含量的提取液6份，分別加入姜黃素對照品溶液，混勻后按照“2.1.1”中色譜條件進樣測定，加樣回收率=（測得量-樣品含量）/加入量，具體結果見表1。

2.2 星點設計實驗

2.2.1 實驗設計與結果

根據預實驗結果確定考察因素為乙醇濃度（A）、時間（B）、液固比（C），采用Design-Expert軟件的星點設計模塊設計出三因素五水平的實驗方案，因素設計見表2。精密稱取姜黃粉末200 mg，按照表1的條件進行3次平行實驗，提取率%=（A為吸光度，a、b為標準曲線參數，V為濾液總體積、F為稀釋倍數、M為姜黃粉末質量），姜黃素的提取率見表3。

2.2.2 模型建立及方差分析

采用Design-Expert 8.0軟件對實驗數據進行二次多元回歸擬合得到回歸方程：Y=3.64-0.079A+0.063B+0.022C+2.204A×10-3-0.02AC-0.035BC-0.05A2-3.64B2×10-3-0.072C2，對該方程進行方差分析及顯著性檢驗，結果見表4。

方差分析中，回歸模型的P < 0.01，R2=0.9769，表明該模型有較高的可信度；失擬項F=0.96，P=0.5173，失擬項不顯著，表明該模型能夠較好且誤差較小地反映響應值的變化。顯著性檢驗中，三種因素A、B、C對姜黃素的得率都有極顯著影響（P < 0.01）；各因素交互作用中B、C項對實驗結果有極顯著影響（P < 0.01），A、C項有顯著影響（P < 0.05），A、B項對試驗結果無顯著性影響。

2.2.3響應曲面分析及參數優化驗證

采用Design-Expert 8.0繪制提取液中姜黃素含量的響應曲面圖，如圖2～4。響應曲面圖可以分析提取條件的交互作用、確定最佳工藝，通過軟件中優化（optimizion）模塊對參數進行優化得到最優值?；貧w模型預測姜黃素最高的得率為3.732%，這時的乙醇濃度為70.89%，提取時間為49.87 min，液固比為15.07∶1。按照最優參數進行驗證實驗，為方便操作令乙醇濃度為70%，超聲時間為50 min，液固比為15∶1。5次平行實驗總姜黃素得率實測平均值為3.715%，標準偏差RSD為0.53%，表明實際值與理論預測值基本吻合，星點設計-響應面優化法得到的提取參數準確可靠，該模型具有良好的預測性。

3討論

姜黃素的提取易受多種因素的影響，例如提取時間、提取溫度和溶液組成等，如何達到最佳提取條件，盡可能提高得率，是研究者們關心的問題。目前對姜黃素的工藝優選主要為正交設計和均勻設計[17-18]，然而當因素水平較多時會產生極大工作量，且存在精確度不高、預測性不好等缺點。星點設計是效應面優化法的一種，它集數學和統計學為一體，是多因素五水平的實驗設計，具有試驗次數少，試驗精度高等特點，在藥學應用上成果顯著[19]。需要注意的是，為避免由考察區域距離最優區域過遠而造成最佳工藝的偏差[20]，星點設計各因素水平的選取范圍及最優中心點的確定應建立在前期的單因素實驗基礎上。

經過最初的單因素考察，優選出姜黃素提取中的影響因素及范圍，本試驗優點在于能夠充分考慮各因素之間的交互作用。數據模型采取二次多項式進行擬合，二項式模型的擬合相關系數高，5次平行試驗平均值與最優條件下理論值基本吻合，說明該模型的可信度和預測性良好，能夠對姜黃素的提取進行較為準確的分析和預測，從而為提取工藝的優選和進一步實際應用提供參考依據。

[參考文獻]

[1] 蘇敬.新修本草[M].合肥：安徽科技出版社，1983.

[2] Akram M，Shahab-Uddin AA，Usmanghani K，et al. Curcuma longa and curcumin：a review article [J]. Rom J Biol-Plant Biol，2010，55：65-70.

[3] Lv L，Shen Y，Liu J，et al. Enhancing curcumin anticancer effi？鄄cacy through di-block copolymer micelle encapsulation [J]. J Biomed Nanotechnol，2014，10（2）：179-193.

[4] 狄建彬，顧振綸，趙笑東，等.姜黃素的抗氧化和抗炎作用研究進展[J].中草藥，2010，41（5）：I0018-I0021.

[5] De Zordi N，Cortesi A，Kikic I，et al. The supercritical carbon dioxide extraction of polyphenols from propolis： a central composite design approach[J].The Journal of Supercritical Fluids，2014，95：491-498.

[6] Huang B，Ke H，He J，et al. Extracts of Halenia elliptica exhibit antioxidant properties in vitro and in vivo [J]. Food Chem Toxicol，2011，49（1）：185-190.

[7] 李子強，白曉光，楊志衡，等.姜黃素類化合物與生物活性研究進展[J].中國醫藥工業雜志，2015，46（3）：305-311.

[8] 趙麗艷，余秀娟，韓天云，等.姜黃素神經保護作用研究進展[J].神經藥理報，2012，2（2）：58-64.

[9] Kumar SSD，Mahesh A，Mahadevan S，et al. Synthesis and characterization of curcumin loaded polymer/lipid based nanoparticles and evaluation of their antitumor effects on MCF-7 cells [J]. Biochimica Et Biophysica Acta，2014， 1840（6）：1913-1922.

[10] 孫永，彭明利.姜黃素及其衍生物在肝臟相關疾病中防治作用的研究進展[J].藥學學報，2014，49（11）：1483-1490.

[11] Goel A，Kunnumakkara AB，Aggarwal BB. Curcumin as "Curecumin"：From kitchen to clinic [J]. Biochem Pharma？鄄col，2008，75（4），787-809.

[12] 趙欣，王愛里，袁園，等.姜黃中姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素的光穩定性分析[J].中草藥，2013， 44（10）：1338-1341.

[13] 張英，李冬梅，邢穎.姜黃素的藥理作用與載體研究進展[J].中國藥房，2015，26（13）：1850-1853.

[14] 袁英髦，曹雁平.低芳香成分姜黃素超聲提取技術研究[J].食品工業科技，2013，34（14）：299-302.

[15] 余小翠，劉高峰.響應面分析法在中藥提取和制備工藝中的應用[J].中藥材，2010，33（10）：1651-1655.

[16] 吳琳，彭欣，孫芳，等.星點設計-效應面優化法與中藥學實驗研究[J].山東中醫藥大學報，2014，21（6）：582-585.

[17] 李揚，張麗，黃力，等.正交法優化姜黃中姜黃素提取工藝研究[J].精細化工中間體，2008，6（38）：22-24.

[18] 周美，陳華國，周欣，等.正交實驗法優化姜黃中姜黃素提取工藝及其抗氧化活性[J].醫藥導報，2015，34（10）：1352-1355.

[19] Suhail AH，Ismail N，Wong S，et al. Response Surface Methodology [J]. Journal of Applied Sciences，2011，11：308-315.

[20] 張威，賈曉斌，劉嘉，等.星點設計-效應面法優化龍葵生物堿提取工藝[J].中國現代應用藥學，2015，32（2）：152-155.

（收稿日期：2016-08-05 本文編輯：王紅雙）