姜黃素干預耐吉非替尼肺腺癌細胞上皮間質轉化的影響及相關機制的研究

陳灝　詹建偉　王利民　陳清勇　葉健

[摘要] 目的 探討姜黃素對耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD細胞的生物學特性影響以及干預其上皮間質化過程（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）的相關機制。 方法 采用體外姜黃素作用于耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD細胞；分別通過形態學、MTT法、transwell實驗檢測經姜黃素干預的耐藥細胞株的形態特征、藥物敏感性和侵襲轉移能力的變化；通過Western blot實驗檢測波形蛋白、上皮鈣粘附分子在藥物作用后的表達差異以及PI3K/AKT/mTOR信號通路中相關蛋白 AKT、mTOR的變化情況。 結果 與人肺腺癌PC9細胞比較，PC9/ZD耐藥細胞株呈間質樣細胞表型；與親代PC9/ZD細胞比較，經姜黃素作用后的PC9/ZD細胞對吉非替尼敏感性明顯增強，轉移能力減弱（75.67±8.82 vs 103.67±13.67）；侵襲能力減弱（17.22±3.63 vs 59.89±8.19）；波形蛋白表達下調（1.07±0.23 vs 1.28±0.28），上皮鈣粘附分子表達上調（0.82±0.27 vs 0.29±0.11）；AKT、mTOR磷酸化減弱（0.20±0.05 vs 0.63±0.17，0.72±0.25 vs 1.10±0.19）。 結論 姜黃素可以通過阻斷PI3K/AKT/mTOR信號通路而明顯干預耐吉非替尼肺腺癌細胞上皮-間質轉化過程。

[關鍵詞] 肺腺癌；吉非替尼耐藥；上皮間質轉化；生物學特性；姜黃素

[中圖分類號] R285.5；R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）32-0001-04

吉非替尼作為一種常規治療肺癌的化療藥物，在臨床上有著不錯的療效，但還有很多肺癌患者會出現原發性耐藥或繼發性耐藥的現象。已有研究表明腫瘤細胞發生上皮間質轉化是其獲得耐藥能力的重要因素之一[1，2]。目前，姜黃素公認為是姜黃中最有效和最豐富的活性成分之一。一方面，姜黃素的抗炎、抗凝、抗氧化等作用不斷被人們所證實[3]；另一方面，姜黃素的抗腫瘤機制也成為熱點[4]。本研究通過體外姜黃素作用于耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD細胞，對其進行分子生物學特性的檢測，分析其干預EMT過程的相關機制，旨在為進一步研究姜黃素干預肺腺癌耐藥細胞發生EMT時所涉及的相關轉錄因子或相關通路打下基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

①吉非替尼（Gefitinib）（阿斯利康制藥有限公司產品）；②DMEM培養基、胎牛血清（Thermo公司產品）；③胰酶、PBS溶液（Hyclone公司產品）；④人結腸癌PC9細胞株（南京凱基生物科技發展有限公司）；⑤人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD細胞株（同濟大學醫學院提供）；⑥甲基偶氮唑藍（MTT）、山羊抗兔IgG二抗、β-actin（biosharp公司產品）；⑦Matrigel膠、transwell小室、培養瓶、離心管（美國CORNING公司）；⑧E-cadherin、Vimentin、mTOR、p-mTOR、AKT、p-AKT、GAPDH一抗（Abcam公司）。

1.2 細胞形態學

采用倒置相差顯微鏡（OLYMPUS 200×）觀察人肺腺癌PC9細胞株和人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD細胞株。

1.3 常規細胞培養

將處于對數生長期人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD細胞株接種至5 cm×5 cm大小的培養瓶，在37℃、5%CO2培養箱中培養。待細胞鋪滿培養瓶80%左右進行傳代?？蓪⒓毎麅龃嬖?80℃的超低溫冰箱中，解凍后細胞活力正常。

1.4 吉非替尼對細胞抑制率的測定

消化離心正常生長的耐吉非替尼PC9/ZD細胞株，并調整細胞濃度為3×104個/mL，在96孔板中每孔加入100 μL細胞懸液（邊緣孔用無菌PBS填充）平均分為對照組和實驗組，均加入用稀鹽酸溶解過濾后濃度為10 μg/mL的吉非替尼藥物溶液，調整每孔吉非替尼濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μg/mL，并在實驗組的小孔中加入姜黃素（Cur），并調整每孔Cur含量為60 μmol/L。設置4個復孔。繼續培養48 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL；置于培養箱4 h后吸去上清液，每孔加DMSO 150 μL，振蕩3 min；采用全自動酶標儀（美國Bio-Tex）檢測波長為490 nm的吸光度（OD值）。計算抑制率，公式為=（1-實驗組/對照組）×100%。

1.5 transwell實驗檢測細胞轉移和侵襲能力

①轉移實驗：消化離心正常生長的耐吉非替尼PC9/ZD細胞株，調整細胞濃度為5×104個/mL，該組為對照組；向細胞懸液加入Cur，使Cur含量為60 μmol/L，細胞濃度也為5×104個/mL，該組為實驗組；然后在每個transwell小室的上室中加入200 μL兩組細胞懸液，同時下室中加入含10%胎牛血清的DEME培養基500 μL；放置于培養箱中常規培養24 h后小心吸去上下小室中的液體，并倒扣于濾紙上2 min；除去上室中未穿出的細胞；室溫固定15 min（4%多聚甲醛）；染色20 min（0.1%結晶紫染色液）；風干后觀察、200倍鏡下拍照和計數（每個小室隨機選取5個視野）。設置3個復孔。②侵襲實驗：先在每個transwell小室的上室加入事先4℃過夜解凍并用DEME培養基稀釋6倍的Matrigel膠60 μL。細胞懸液密度變為8×104，其余步驟同轉移實驗。

1.6 Western blot實驗檢測細胞蛋白表達

常規培養的PC9/ZD細胞為對照組。預用含Cur含量為60 μmol/L的培養基培養48 h的PC9/ZD細胞為實驗組。采用裂解液（PMSF∶RIPA=1∶100）提取細胞總蛋白。蛋白濃度是由RIPA裂解液調整為5 μg/μL，然后使蛋白高溫下變性。配制分離和濃縮膠濃度為5%和10%，然后用恒壓100 V進行電泳1 h，待電泳結束后進行轉膜，轉膜條件為冰浴、恒流2 h。封閉將轉膜后的PVDF膜在4℃過夜條件下進行一抗處理。次日洗膜3次，進行二抗處理，37℃、1 h。再次洗膜3次用ECL顯色后采用Quantity One軟件（Bio-Rad）進行半定量比較分析。

1.7 統計學處理

采用SPSS16.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，并進行兩獨立樣本的t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞株形態

倒置相差顯微鏡（OLYMPUS 200×）直接觀察人肺腺癌PC9細胞株和人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD細胞株。在200倍鏡下觀察發現，PC9細胞表現為上皮樣形態，細胞大小均勻，為立方形或圓形；而PC9/ZD細胞株表現為間質樣形態，細胞大小不一，甚至為多邊形，細胞間距增大，并且有明顯的偽足（封三圖1）。

2.2 吉非替尼對兩組細胞的抑制率比較

吉非替尼對兩組細胞抑制效果見表1，并以吉非替尼濃度為橫坐標，細胞抑制率為縱坐標，繪制圖表（封三圖2）。結果顯示隨著吉非替尼濃度增加，吉非替尼對兩組細胞的抑制作用逐漸增強；并且在同樣藥物濃度作用下，實驗組抑制率明顯高于對照組（除1.0 μg/mL）（P<0.05）。

2.3 對照組與實驗組轉移能力和侵襲能力比較

轉移和侵襲實驗中，對照組穿過小室細胞數分別為（103.67±13.67）和（59.89±8.19）。實驗組穿過小室細胞數分別為（75.67±8.82）和（17.22±3.63），表明姜黃素可以明顯干擾人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD細胞株轉移（t=2.77，P=0.011）和侵襲能力（t=2.41，P=0.016），見封三圖3。

2.4 兩組EMT相關蛋白表達及PI3K/AKT/mTOR信號通路p-AKT、p-mTOR比較

Western blot 實驗結果顯示，與對照組比較[蛋白相對含量E-cadherin和Vimentin分別為（0.29±0.11）和（1.28±0.28）]，實驗組的E-cadherin表達上調[蛋白相對含量為（0.82±0.27）]，Vimentin表達下調[蛋白相對含量為（1.07±0.23）]（圖1），表明姜黃素干預上皮間質化的過程，使得上皮標志蛋白表達上調，間質標志蛋白表達下調。另一方面，相比于對照組[蛋白相對含量p-AKT和p-mTOR分別為（0.63±0.17）和（1.10±0.19）]，實驗組的p-AKT[蛋白相對含量為（0.20±0.05）]、p-mTOR[蛋白相對含量為（0.72±0.25）]也呈現低表達的狀態（圖2），說明姜黃素阻斷PI3K/AKT/mTOR 信號通路，進而改變上皮間質轉化的過程。

3討論

肺腺癌的治療是一個多學科綜合治療的過程，包括手術、化療和靶向治療等。吉非替尼作為治療肺腺癌的臨床一線化療藥物應用十分廣泛，主要從三個方面發揮藥理作用：①競爭EGFR-TK催化區域上Mg-ATP結合位點，阻斷其信號傳遞；②抑制有絲分裂原活化蛋白激酶的活化，促進細胞凋亡；③抑制腫瘤血管[5]。但臨床上常發生腫瘤細胞對其產生耐藥的現象從而導致化療失敗和預后不良[6]。腫瘤細胞的多藥耐藥（MDR）可分為原發性耐藥和獲得性耐藥兩種類型[7]。

目前，普遍認為肺腺癌的轉移和侵襲過程以及獲得耐藥能力的過程中均可能與EMT有關。李優等[8]研究表明，通過干預PI3K/AKT/mTOR信號通路可以使EMT相關的E-鈣粘蛋白、波形蛋白表達發生改變，從而減弱經TGF-β1誘導的肺腺癌細胞侵襲和轉移能力。腫瘤細胞發生上皮間質轉化時，一些經典的信號傳導通路已經被證實，如HGF/c-Met信號轉導通路、轉錄因子Snail家族、β-連環蛋白通路、β-連環蛋白與磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B途徑等[9-11]。此外還有學者研究發現，腫瘤細胞發生轉移侵襲與其發生EMT時腫瘤細胞的基質金屬蛋白酶表達上調、改變細胞微環境有關[12]。由此可見，通過干預腫瘤細胞EMT的發生能夠成為治療癌癥的新方向。

姜黃素可以通過多種途徑干預腫瘤細胞的生物學行為，如 Wnt/β-catenin 信號傳導通路、PI3K/AKT/mTOR信號通路、細胞核轉錄因子-κB（NF-κB） 和STAT-3 信號通路等[8，13，14]。龐慧芳等[15]通過實驗發現姜黃素能夠逆轉TGF-β1誘導的胰腺癌 PANC-1 細胞的EMT過程，降低胰腺癌的惡性程度從而達到治療的目的。姜黃素的抗腫瘤作用越來越被重視。美國國立癌癥研究所已經將其列為第三代抗癌預防藥，因為其治療效果顯著、不良反應少、安全性高等特點，在日本廣泛應用[16]。本實驗結果顯示，相比于親代耐藥細胞，經姜黃素處理的耐吉非替尼肺腺癌細胞對吉非替尼的敏感性明顯改善；轉移和侵襲能力也相應地減弱；上皮間質化標志蛋白Vimentin表達下調，E-cadherin表達上調。上述結果均說明姜黃素對耐吉非替尼肺腺癌生物學行為的改變甚至逆轉上皮間質化的過程。

在腫瘤發生發展的過程中，PI3K/AKT/mTOR信號傳導通路扮演著重要角色[17]。在多種惡性腫瘤細胞中均能發現PI3K/AKT/mTOR信號傳導通路處于異常激活狀態，與惡性腫瘤的各種生物學行為密切相關[18]。因此，針對該信號通路的研究和靶向藥物的應用成為熱點。有研究發現可以通過使PI3K/AKT/ARK5信號通路處于活化狀態促進Snail蛋白進細胞核從而使細胞發生上皮間質化[19，20]。本實驗結果顯示，相比于親代耐藥細胞，姜黃素改變耐吉非替尼肺腺癌細胞的AKT、mTOR蛋白磷酸化。上述結果同時與Vimentin表達下調、E-cadherin表達上調相吻合，共同說明經姜黃素處理后，耐吉非替尼肺腺癌上皮間質化的過程被阻斷甚至逆轉。

結合國內外相關文獻和實驗結果提示姜黃素對耐吉非替尼肺腺癌上皮間質化有明顯作用，為下一步實驗提供了理論基礎，進一步研究分子機制，通過基因檢測等其他手段明確姜黃素藥理作用與EMT的內在聯系，為逆轉EMT以及抑制腫瘤發生發展提供新的證據。

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（收稿日期：2016-07-09）