酶聯免疫吸附分析法應用于戰場水環境TNT檢測的可行性研究

劉婧婷++譙華++馮孝杰++陳志莉

摘要：為了快速檢測戰場水環境中TNT含量以判斷水源可用性，提出了建立關于TNT的酶聯免疫吸附分析法（ELISA）。分析ELISA的建立要點：根據TNT分子結構官能團的可改造性提出了合成半抗原的3種方法；對應3類半抗原采用不同蛋白偶聯方法合成3種人工抗原；分析動物體對TNT人工抗原可產生有效免疫應答并可獲得滿足ELISA要求的抗血清；樣品前處理方法可滿足快速檢測要求。從理論證明建立TNT的ELISA并滿足檢測要求的可行性；同時，提出了利用此法檢測待解決和優化的問題。

關鍵詞：TNT；水環境；酶聯免疫吸附分析法；半抗原；抗血清

中圖分類號：TJ41；X832 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）01-0125-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.01.032

Feasible Analysis about Detection of TNT Concentration in Battlefield Water Environment by Enzyme-linked Immunosorbent Assay

LIU Jing-ting，QIAO Hua，FENG Xiao-jie，CHEN Zhi-li

（Dept. of National Defense Architecture Planning&Environmental Engineering，Logistic Engineering University of PLA，Chongqing 401311，China）

Abstract： To determine the availability of water sources by rapidly detecting the TNT concentration in battlefield water environment，the enzyme-linked immunosorbent assay of TNT was put forward. The key points of ELISA method were analyzed as below：three kinds of semi-antigen methods were proposed based on modification of TNT functional groups. Three artificial antigens were synthesized by employing different proteins coupling reactions corresponding to three kinds of semi-antigens. Artificial antigens of TNT stimulated animals to produce effective immune responses and produced antiserum to comply with requirements of ELISA. Sample pretreatment method was suitable for the rapid detection. Above research theoretically proved that the ELISA method was feasible and satisfactory for detecting TNT. Meanwhile，some problems urgently needed to be solved and optimized by the method were put forward.

Key words： trinitrotoluene； battlefield water environment； enzyme-linked immunosorbent assay； semi-antigen； antiserum

在現代化軍事行動中，為作戰部隊保質保量提供生活用水是后勤保障系統職責所在。后勤工程學院于2002年自主研發的NJC2002-100/80凈水車是能滿足部隊執行多樣化軍事任務時的應急供水保障裝置。該凈水車可利用戰場環境中現有江河、湖泊水源就地取水，通過研發設計的水質凈化程序使出水達到直飲水標準。但該凈化程序只可對未受污染水源進行簡易的消毒凈化處理，而對于復雜戰場環境尤其是對于極可能受到彈藥污染水源則不能進行有效的檢測判斷。因此，快速有效地檢測戰地水源水質成為凈水車取用水與否的先決條件。

目前被廣泛用于各種軍隊裝置及軍事武器的爆炸性物質主要有梯恩梯（TNT）、地恩梯（DNT）、黑索金（RDX）、奧克托今（HMX）等[1]，其中硝基芳烴類化合物TNT居彈藥用量首位，因此也是最為常見的戰場水源污染物質[2]。TNT全稱為2，4，6-三硝基甲苯，又名對稱三硝基甲苯，是由甲苯經過三段硝化而制成的，其分子式為C7H5N3O6，相對分子質量227.13，結構式見圖1。TNT屬高度危害毒物，水體濃度大于2 ng/mL時即可引起亞急性中毒、慢性中毒，給身體造成不可逆的損害。目前常用于TNT檢測的方法有質譜[3]、離子遷移光譜[4-6]、表面等離子共振[7]、分子印跡聚合物[8，9]，熒光偏振法[10]，但大都存在前處理繁瑣，操作復雜，檢測時間長且成本高的問題。因此快速高效的現場檢測方法對戰場水環境即時分析顯得尤為重要。酶聯免疫吸附分析（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）作為一種高效的生物分析技術，因其反應靈敏、特異性強、可進行現場測定等優點[11，12]，成為快速檢測目標污染物的重要手段。本研究通過分析TNT的ELISA方法建立要點，討論該方法應用于戰場水源環境中TNT檢測的可行性。

1 原理與方法

1.1 ELISA基本原理

ELISA作為常用的酶標記免疫分析方法，是一種依賴抗原抗體特異性與酶高效催化反應有機結合的綜合性檢測技術，原理是采用抗原與抗體的特異性反應將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產生顏色的深淺進行定量的測定[13]。因此利用目標物質TNT合成人工抗原后進行動物免疫產生特異性抗血清是方法建立的關鍵，而后根據ELISA檢測步驟即可對經過前處理的水環境樣品進行檢測。

1.2 ELISA方法建立

1.2.1 半抗原合成 ELISA方法作為一種依賴抗原抗體特異性結合反應與酶高效催化反應有機結合的綜合性檢測技術，關鍵在于制備出針對目標物質的抗血清。由于TNT半抗原屬于小分子物質，不能引起動物免疫反應，因此需要與載體蛋白質偶聯以形成免疫原。另外TNT為對稱三硝基穩定結構，不含與蛋白質直接反應的活潑官能團，因此需先將其官能團進行氨基化、羥基化或羧基化，具體反應可參考圖2，圖2中R代表TNT被取代硝基以外部分。

1.2.2 人工抗原合成 從上述TNT改造分子中選擇兩種或兩種以上分別作為ELISA方法的免疫原分子與包被原分子。結合TNT官能團活化情況，分析采用活性酯法、戊二醛法、琥珀酸酐法等將其分別與不同的蛋白偶聯合成人工免疫原和包被原，如圖3所示，圖3中R代表TNT被取代硝基以外部分。目前常用的載體蛋白有牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）、兔血清白蛋白（Rabbit serum albumin，RSA）、鎖孔血藍蛋白（Keyhole limpet hemocyanin，KLH）及卵白蛋白（Ovalbumin，OVA）等。其中常用的KLH即血藍蛋白，具有很高的免疫性，蛋白本身會刺激動物體形成免疫應答形成抗體，可能影響目標物質抗體純度；BSA與KLH相比較屬弱抗原化物的載體蛋白，它是最穩定的可溶白蛋白，便于后期檢測偶聯效果；OVA可作為包被原蛋白以與免疫原蛋白進行區別。趙晨等[10]在TNT的熒光偏振免疫檢測方法研究中，將TNT羧基化后采用活性酯法與BSA成功進行偶聯合成人工抗原TNT-BSA。

1.2.3 抗血清制備 免疫原合成后按照表1流程進行抗血清制備。選取新西蘭大白兔作為免疫主體，首次免疫后2周進行加強免疫，而后每隔1周進行1次加強免疫。有研究表明，采用該方法對動物體進行關于2，2，4，4-四溴聯苯醚的人工抗原刺激免疫[14]，免疫效果良好，所得抗血清效價達到ELISA方法抗血清效價要求。為保證獲取高質量抗血清，可將免疫原分子與不同載體蛋白質偶聯合成數種免疫原進行動物免疫，比較選取效價高、性質穩定的抗血清建立TNT的ELISA方法。趙晨等[10]制備的TNT-BSA抗血清達到工作濃度，證明動物體對TNT人工抗原具有免疫應答性。

1.2.4 樣品前處理 由于ELISA方法所采用的抗血清是對目標化合物進行特異性識別，因此不需要富集分離等復雜的樣品前處理步驟。采集的水樣經玻璃纖維濾紙過濾后，加入1∶1體積有機溶劑超聲后即可檢測。有研究表明采用此方法進行多溴聯苯醚加標環境樣品的前處理，回收率為66.20%～88.57%[14]。若環境樣品濃度過低，采用固相萃取小柱進行萃取富集即可檢測[15]。

TNT作為目標物質具有可活化基團，具備合成多種半抗原的基礎條件；TNT人工抗原可刺激動物形成免疫應答，獲得抗血清效價可達到ELISA檢測要求；樣品前處理操作簡單快捷，目標物質回收率達到微量或痕量物質檢測要求，滿足對戰場水環境快速準確判斷要求。

2 待解決問題

所制備TNT抗血清除對TNT進行特異性識別外，還可能與彈藥中常見的二硝基甲苯、硝基苯甲酸、多硝基甲酚、多硝基苯、多硝基酚等硝基芳烴類物質結合，造成檢測結果偏高或是假陽性結果。因此，還需對上述物質進行交叉反應率（CR）的檢測，計算公式為：交叉反應率（CR）=（待測物IC50/類似物IC50）×100%。

ELISA方法根據酶催化產生的有色產物量形成的吸光度差異對待測物質進行定量分析，反應的時間、孵育溫度等因素都會影響酶活性繼而導致顯色結果偏差[16]。因此，還需為適應戰地復雜環境條件建立適應性強、穩定性高的檢測條件。

ELISA試劑盒是基于ELISA原理設計生產的小型成套分析裝置和試劑，可將TNT抗血清純化獲得TNT單克隆抗體用以研發便攜試劑盒，提高現場檢測能力。

3 小結

通過分析TNT的ELISA法建立原理與要點，分析得出利用該方法快速檢測戰地水源中TNT含量是可行的。但戰地環境復雜，仍需通過大量模擬測試進行方法驗證，另外還有若干問題亟待解決和改進，本研究僅為快速判斷戰場水源安全性提供一種新的檢測方法以供參考。

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