茵陳提取物中化學成分的UHPLC—LTQ—Orbitrap快速鑒定

歐陽文竹+尚展鵬+王文建+王守旭+沈家序+錢浩+馬志國+張加余

[摘要]應用UHPLC-HR-MSn技術分析檢測茵陳提取物中的化學成分。采用ACQUITY UPLC HSS T3 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱和0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）流動相系統進行梯度洗脫；應用LTQ-Orbitrap質譜負離子模式檢測茵陳提取物中的化學成分。根據精確分子量數據和多級質譜碎片離子，結合對照品比對和文獻報道，共從茵陳提取物中分析鑒定了50個化學成分，包括21個黃酮、22個有機酸、6個香豆素和1個其他類成分。應用UHPLC-LTQ-Orbitrap高分辨液質聯用技術較為全面地闡明了茵陳提取物中的化學成分，為進一步研究茵陳提取物的全面質量控制方法、體內代謝過程以及藥效物質基礎提供了科學依據。

[關鍵詞]茵陳提取物； 液質聯用技術； 化學成分鑒定

[Abstract]A rapid and sensitive UHPLC-HR-MSN method was developed for the identification of chemical constituents in capillary wormwood extract. ACQUITY UHPLC HSS T3 chromatography column （2.1 mm×100 mm， 1.7 μm） was used with 0.1% formic acid-acetonitrile solution as the mobile phase in gradient elution. The extract was detected by ESI-LTQ-Orbitrap equipped with an ESI ion source in a negative mode. Based on the accurate mass measurements， retention time， mass fragmentation patterns and literature reports， a total of 50 compounds including 21 flavonoids， 22 phenolic acids， 6 coumarins and 1 other compound were tentatively screened and characterized. These results are helpful for the comprehensive quality control， better comprehension of the metabolism and further study of pharmacodynamic substance from capillary wormwood extract.

[Key words]capillary wormwood extract； UHPLC-LTQ-Orbitrap MS； chemical constituent identification

茵陳為菊科植物濱蒿Artemisia scoparia Waldst.et Kit.或茵陳蒿A. capillaries Thunb.的干燥地上部分。我國大部分地區均有分布，主產于安徽、浙江、江蘇、陜西等省。春季和秋季采收茵陳的分別習稱“綿茵陳”和“花茵陳”^[1]。茵陳味苦、辛，性微寒，歸脾、胃、肝膽經，具有清熱利濕、利膽退黃之功效，是一種具有保肝功效的特色中藥，常與其他中藥配伍用于治療甲、乙型和黃疸型肝炎?，F代研究表明，茵陳中的主要化學成分包括黃酮、有機酸、香豆素、色原酮以及揮發油等。茵陳提取物則是綿茵陳經提取制成的，其質量標準被收載于《中國藥典》2015年版一部^[2]。目前，現行標準中僅對綠原酸等成分進行質量控制，其他成分尚不明確。這無疑不利于茵陳提取物的全面質量控制和藥效物質基礎研究。因此，亟需建立一種快速、簡便的分析方法來全面闡明茵陳提取物中的化學成分。

LC-MS技術具有靈敏度高、選擇性強且碎片離子重現性好等諸多優點，已廣泛用于中藥化學成分的結構鑒定^[3-5]。其中，線性離子阱與Orbitrap傅里葉掃描質譜組成的串聯質譜儀（LTQ-Orbitrap hybrid mass spectrometry）將線性離子阱的多級質譜功能和Orbitrap高分辨能力質譜結合起來，可同時實現多級質譜碎裂和母離子的高分辨數據采集，為小分子藥物及大分子蛋白質的鑒定提供更準確信息^[6-8]。本文基于UHPLC-LTQ-Orbitrap建立茵陳提取物中化學成分的分析方法，并結合精確分子質量數據、碎片離子和對照品比對等手段進行結構鑒定，以期為闡明其物質基礎進而建立全面的質量控制方法提供科學依據。

1 材料

Ultimate 3000超高效液相色譜儀與LTQ-Orbitrap XL 質譜，配有電噴霧離子源（ESI），Xcalibur 2.1 工作站（美國Thermo Scientific公司）；Millipore Synergy UV 型超純水機（美國Millipore 公司）；KQ-250DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；R200D 型電子分析天平（1/10萬，德國Sartorius 公司）。

菌除法藥材產地為廣東梅州，經暨南大學藥學院張英副教授鑒定為菊科植物茵陳蒿A.capillaris的干燥地上部分。

5-咖啡?？鼘幩幔ㄅ?10753-200413）購自中國食品藥品檢定研究院；3-咖啡?？鼘幩?、4-咖啡?？鼘幩?、1，5-二咖啡?？鼘幩?、3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡?？鼘幩岬葘φ掌焚徸猿啥悸继厣锟萍加邢薰?。所有對照品純度均大于98%。乙腈和甲醇（質譜級，德國Merck公司），甲酸（色譜級，德國Merck公司），其他均為分析純。

2 方法

2.1 茵陳提取物的制備

取綿茵陳，用90%乙醇作為溶劑，浸漬24 h后進行滲漉，收集滲漉液，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.10～1.15 （60～65 ℃）的清膏，加6倍量水，冷藏，靜置，濾過，濾液120 ℃加熱1 h，冷藏，靜置，加入0.2%活性炭，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.15～1.20 （60～65 ℃）的清膏，80 ℃真空干燥，即得。

2.2 混合對照品溶液的制備

分別取上述6種對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度約為100 mg·L^-1的儲備液；分別精密吸取各儲備液適量，加甲醇定容于5 mL量瓶中，即得。

2.3 供試品溶液的制備

稱取茵陳提取物0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液25 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，混勻，靜置，取上清液，以0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.4 色譜條件

色譜柱ACQUITY UHPLC HSS T3 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫0～4 min，3%～19% B，4～10 min，19%～20% B，10～13 min，20%～21% B，13～17 min，21%～40% B，17～20 min，40%～90% B；柱溫35 ℃，流速為0.40 mL·min^-1；檢測波長327 nm；進樣量5 μL。

2.5 質譜條件

負離子檢測模式，毛細管溫度350 ℃，鞘氣流速30 arp，輔助氣流速10 arp，噴霧電壓3 kV，毛細管電壓-35 V，管透鏡電壓-110 V。樣品采用FT進行FS掃描和PIL掃描，分辨率為3萬，掃描范圍m/z 100～800，隔離寬度2；二級和三級質譜采用數據依賴性掃描，選取上一級豐度最高的2個峰進行碰撞誘導解離碎片離子掃描，激活單位0.25 q，激活時間30 ms，歸一化碰撞能量為35%。

3 結果

應用 HPLC-DAD-LTQ-Orbitrap MSN法，結合多級質譜碎片離子信息、對照品比對以及相關文獻報道，對茵陳提取物中的4大類50個化合物進行了分析鑒定，其中包括黃酮21個、有機酸22個、香豆素6個以及其他類1個?；旌蠈φ掌泛鸵痍愄崛∥锏?HPLC-DAD 色圖譜與總離子流圖（TIC）見圖1，各類成分的歸屬信息見表1。

3.1 黃酮類化合物的鑒定

本實驗從茵陳提取物中篩選鑒定了21個黃酮類化合物，其中包括黃酮醇11個，黃酮4個，二氫黃酮3個，二氫黃酮醇、查爾酮以及黃烷酮各1個。

3.1.1 黃酮醇類化合物 主要包括9個黃酮醇糖苷和2個黃酮苷元?；衔?8和45的準分子離子峰分別為m/z 301.033 7 [M-H]-和m/z 299.054 9 [M-H]-，由此推斷它們的分子式為C₁₅H₁₀O7 （誤差-1.99）和C₁₆H12O6 （誤差-0.33）。在化合物48的ESI-MSN譜中，m/z 301首先丟失1分子H₂O產生m/z 283，再失去1分子CO產生m/z 255，同時還產生RDA碎片離子1，3A-m/z 151。經相關文獻對比后將其鑒定為槲皮素^[9-10]。而化合物45的m/z 299[M-H]-在多級質譜裂解中產生RDA碎片離子m/z 193 （C9H₅O₅-）。結合文獻中的茵陳化學成分相關報道，將其鑒定為鼠李檸檬素^[11-12]。

化合物22，30和31的準分子離子峰均為m/z 463.08 [M-H]-，且在ESI-MS²譜均出現m/z 301，說明它們可能是以槲皮素或異槲皮素為苷元的黃酮醇糖苷。而中性丟失的糖基團相對分子質量為162表明三者可能是葡糖糖苷或半乳糖苷。同時，三者均產生m/z 179 和m/z 151 的特征RDA碎片離子。結合在茵陳中已報道的化學成分，將它們依次推斷為槲皮素-7-O-葡萄糖苷、金絲桃苷和槲皮苷^[13]。

化合物32和39的準分子離子峰均為m/z 447.09 [M-H]-，說明二者為同分異構體。然而，二者的多級質譜圖存在較大差異，說明它們的母核并不相同?；衔?2產生苷元碎片離子m/z 301，

4.3-咖啡?？鼘幩?；7.5-咖啡?？鼘幩?；9.4-咖啡?？鼘幩?；16.1，3-二咖啡?？鼘幩?；34.1，5-二咖啡?？鼘幩?；43.4，5-二咖啡?？鼘幩?；A. 6個對照品溶液UHPLC圖譜；B. 茵陳提取物UHPLC圖譜； C. 6個對照品溶液TIC圖； D.茵陳提取物TIC圖。

可將其鑒定為槲皮素-3-O-鼠李糖苷^[13]?；衔?9的[M-H]-離子m/z 447.09則中性丟失相對分子質量為162后生成m/z 285，并進一步中性丟失1分子CO產生m/z 257，由此將其鑒定為山柰酚-3-O-葡萄糖苷^[14]。

化合物36的準分子離子峰為m/z 623.160 0，由此推斷其分子式為C28H32O₁₆，誤差為1.1。其二級離子碎片離子m/z 315表明其苷元可能為異鼠李素，而中性丟失的碎片離子質量數m/z 308則表明為其可能是刺槐糖苷。在進一步的質譜裂解過程中，m/z 315丟失1分子CH₃·后產生m/z 300，然后繼續失1分子HCO·和CO分別產生m/z 271和m/z 243，進一步驗證了上述推斷。由此，將化合物36鑒定為異鼠李亭-3-O-刺槐苷。經分析，化合物33和42與化合物36具有相同的母核，只是糖取代種類不同。結合文獻報道，將化合物33和42分別鑒定為異鼠李素-3-O-半乳糖苷和異鼠李素-3-O-葡萄糖苷^{[9，15]}。

化合物17的準分子離子峰為m/z 609.142 9 [M-H]-，由此推斷其分子式為C₂₇H29O16 （誤差-3.45）。在多級質譜裂解過程中，m/z 609 中性丟失其糖基團后得到碎片離子m/z 301（典型的黃酮醇苷元）。而m/z 301在ESI-MS3譜中則產生m/z 179 和m/z 151，這與槲皮素的裂解方式基本一致。因此將其鑒定為蘆丁。

3.1.2 黃酮類化合物 主要包括9個黃酮醇糖苷和2個黃酮苷元?；衔?3的準分子離子峰為461.071 4 [M-H]-，可推斷其分子式為C₂₇H29O₁₆ （誤差-0.22）。在其ESI-MS²譜中，苷元離子m/z 285表明其可能為木犀草素的葡萄糖苷；而其他碎片離子m/z 443 [M-H-H₂O]-和m/z 415 [M-H-H₂O-CO]-，進一步表明該化合物為木犀草素-7-O-葡糖糖苷^[16]。

化合物40的準分子離子峰為269.043 8 [M-H]-，最有可能的分子式為C₁₅H9O5 （誤差-2.23）。結合文獻報道以及分子式推測其可能是芹菜素^[17]。而m/z 269通過中性丟失H₂O+CO后產生m/z 223以及RDA 碎片離子m/z 121（C7H₃O4-）則進一步驗證了上述推斷。

化合物5的準分子離子峰為m/z 313.070 5 [M-H]-，可知其分子式為C₁₇H14O₁₆ （誤差-0.22）。在進一步的質譜裂解過程中，m/z 313分別產生m/z 298 [M-H-CH₃·]-，283 [M-H-2CH₃·]-，255 [M-H-2CH₃·-CO]-。結合文獻報道，將其鑒定為薊黃素^[18]。同理，可將化合物49鑒定為芫花素^[1]。

3.1.3 其他黃酮類化合物 主要包括二氫黃酮3個（化合物25，35，41）、二氫黃酮醇（化合物38）、查爾酮（化合物14）以及黃烷酮（化合物50）各1個?；衔?5和41的準分子離子峰均為m/z 271.06[M-H]-（C₁₅H11O₅，誤差<2）。在ESI-MS²譜中，二者均產生二氫黃酮類化合物典型的RDA碎片離子m/z 151（C7H₃O4-），由此可將兩者分別鑒定為柚皮素或其同分異構體?；衔?5的準分子離子峰為m/z 285.074 9 [M-H]-，可知其分子式為C₁₆H13O5 （誤差-3.16）。在進一步的質譜裂解過程中，其主要通過發生RDA裂解產生m/z 165和m/z 121等碎片離子。根據相關文獻[9]，將其鑒定為8-去甲基杜鵑素。

化合物38的準分子離子峰為m/z 301.070 9 [M-H]-，可知其分子式為C₁₆H13O6 （誤差0.66）。其主要ESI-MSN碎片離子m/z 165 （C8H₅O4-）是m/z 301丟失B環部分后產生的，同時還繼續脫去1分子CO₂產生m/z 135。結合相關文獻報道^[9]，將其鑒定為7-甲基香橙素。

化合物14的準分子離子峰為m/z 593.149 4 [M-H]-，可知其分子式為C₂₇H₂9O15 （誤差-1.18）。在隨后的多級質譜裂解過程中，其進一步產生m/z 575 [M-H-H₂O]-，473 [M-H-H₂O-C8H8O]-，353 [M-H-H₂O-2C8H8O]-，由此將化合物14鑒定為紅花黃色素A。

化合物50具有典型的黃酮類化合物的碎片離子峰如m/z 255，179，151等。結合相關文獻報道^[19]，可將其鑒定為 （-）-表阿夫兒茶精。

3.2 有機酸類化合物的鑒定

本實驗從茵陳提取物中鑒定了22個有機酸，其中21個為綠原酸類化合物，1個為原兒茶酸。按照奎寧酸上的咖啡酰、對香豆酰以及阿魏酰等取代基的數目，可將綠原酸類化合物分為單取代（11個）、雙取代（8個）以及三取代（2個）等 [20-21]。

3.2.1 單取代奎寧酸類化合物 主要包括咖啡?？鼘幩?個、對香豆?？鼘幩峒捌滠疹惢衔?個，阿魏?？鼘幩?個?；衔?，4，7，9均產生準分子離子峰m/z 353.09，可知其分子式為C₁₆H₁₇O9 （誤差< 5）。通過與對照品比對，將化合物4，7，9分別準確鑒定為新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸。同時，化合物3同樣產生m/z 191 [quinic acid-H]-和m/z 179 [caffeic acid-H]-等主要碎片離子，結合文獻報道中綠原酸同分異構體在反相色譜柱上的保留行為差異，將其鑒定為1-咖啡?？鼘幩?sup>[22]。

化合物的6和15的準分子離子峰為m/z 337.09，可推斷其分子式為C₁₆H₁₇O8，誤差均小于3。在ESI-MS²譜中，m/z 337分別產生各自的基峰離子m/z 163和m/z 173，由此可將二者分別鑒定為3-對香豆?？崴岷?-對香豆?？崴?sup>[23]?；衔?0，13，20則產生準分子離子峰m/z 449.14，可推斷分子式為C22H₂₇O13，誤差均小于5。在ESI-MS²譜中，m/z 449均可通過中性丟失1分子葡萄糖殘基（162）產生m/z 337，說明它們可能是對香豆?？鼘幩崞咸烟擒?。同時，在ESI-MS²譜中，其他主要碎片離子m/z 191，173，163的產生表明它們的苷元可能是5-對香豆?？鼘幩?、4-對香豆?？鼘幩岷?-對香豆?？鼘幩?。由于苷元上的羥基取代位點較多，單純應用LC-MS方法難以確定葡萄糖在苷元上的取代位置。因此，僅將它們鑒定為5-對香豆?？鼘幩崞咸烟擒?、4-對香豆?？鼘幩崞咸烟擒蘸?-對香豆?？鼘幩崞咸烟擒?。

化合物18和19均產生準分子離子峰m/z 367.10。根據所獲得的高分辨質譜精確分子質量以及多級質譜碎片離子信息，推斷最可能的分子式為C₁₇H19O9，誤差均小于2，表明它們可能是阿魏?？鼘幩犷惢衔?。在負離子檢測模式下，化合物18和19的ESI-MS²譜圖存在差異：m/z 367分別產生m/z 191和m/z 173的基峰離子。參考文獻[23]，將化合物18和19分別鑒定為5-阿魏?？鼘幩岷?-阿魏?？鼘幩?。

3.2.2 雙取代奎寧酸類化合物 化合物16，34，37，43均產生準分子離子峰m/z 515.11 [M-H]-。根據所獲得的高分辨質譜精確分子質量可推斷其分子式為C25H23O12，誤差小于5。在多級質譜裂解過程中，m/z 515均產生特征碎片離子m/z 353 [M-H-C6H₁₀O6]-，由此推斷這4個化合物為雙咖啡?？鼘幩?。通過與對照品的色譜保留時間、質譜準分子離子峰以及多級質譜裂解碎片離子信息相比對，可將化合物34，37，43準確鑒定為1，5-二咖啡?？鼘幩?、3，5-二咖啡?？鼘幩岷?，5-二咖啡?？鼘幩?sup>[24]?；衔?6的m/z 515依次中性丟失咖啡?；鶊F，產生m/z 353和m/z 191。同時，m/z 353進一步裂解產生ESI-MS3譜基峰離子m/z 191，且m/z 179的相對豐度也接近50%，由此確定其分子中有1個3-咖啡?；〈?。結合其他碎片離子，如m/z 173 [M-H-2Caffeoyl-H₂O]-等，可將其鑒定為1，3-二咖啡?？鼘幩?sup>[25]。

化合物21，27，29均產生準分子離子峰m/z 529.13 [M-H]-。根據所獲得的高分辨質譜精確分子質量可推斷其分子式為C26H25O12，誤差小于5。在進一步的質譜裂解過程中，m/z 529可以通過丟失1分子咖啡?；虬⑽乎；謩e產生m/z 367 或m/z 353，說明它們是阿魏?？Х弱？鼘幩犷惢衔铮ɑ旌闲停?。由于在質譜數據采集過程中未獲得足夠的碎片離子信息，尚難以確定咖啡?；虬⑽乎；诳鼘幩崮负松系娜〈恢?。因此，僅將這3個化合物分別鑒定為咖啡酰阿魏?？鼘幩?1、咖啡酰阿魏?？鼘幩?2和咖啡酰阿魏?？鼘幩?3。

化合物44產生準分子離子峰m/z 475.088 0 [M-H]-，由此推斷其分子式為C22H19O11（誤差 1.89）。m/z 475在進一步的裂解過程中，通過中性丟失1分子咖啡?；a生m/z 313（對應香豆?？崴幔?，由此可以將其鑒定為香豆?？Х弱？鼘幩?。其另一重要碎片離子m/z 191的產生也進一步印證了上述推斷。但是，由于缺乏相應的對照品，香豆酰和咖啡酰在奎寧酸母核上的具體取代基位置尚難以確定，由此將僅化合物44鑒定為香豆?？Х弱？鼘幩?。

三取代奎寧酸類化合物：化合物46和47在負離子模式下均產生準分子離子峰m/z 677.15 [M-H]-，由此推斷其分子式為C34H29O₁₅ （誤差<3）。在它們的ESI-MS/MS裂解過程中，m/z 677依次丟失1分子咖啡?；螽a生m/z 515和m/z 353，同時產生了m/z 191和m/z 173等特征碎片離子，由此推斷它們為三咖啡?？鼘幩犷惢衔?。由于缺乏相應的對照品，咖啡?；诳鼘幩崮负松系娜〈恢蒙须y以確定，因此僅將化合物46和47鑒定為三咖啡?；鼘幩?1和三咖啡?；鼘幩?2。

其他有機酸類化合物：化合物2產生準分子離子峰m/z 315.070 6 [M-H]-，由此推斷其分子式為C13H₁₅O9（誤差-1.59）。在進一步的質譜裂解過程中，m/z 315可通過中性丟失1分子葡萄糖產生m/z 153，并可繼續丟失1分子CO₂產生m/z 109。結合文獻報道^[23]，可將其鑒定為原兒茶酸-3-O-葡萄糖苷。

3.3 香豆素類化合物的鑒定

本實驗從茵陳提取物中鑒定了6個香豆素類化合物。通過查閱文獻得知，茵陳中香豆素類化合物母核上的取代基主要有-OH和-OCH₃。結合高分辨質譜數據中準分子離子峰[M-H]-的精確質量數和文獻報道^[26]，初步確定化合物8，11，12，24，26，28為香豆素類化學成分。在ESI-MS/MS裂解過程中，[M-H]-離子的特征裂解方式為中性丟失CO，CH₃·和H₂O等，并產生相應的碎片離子。由此，對上述6個香豆素類化合物的結構進行了推斷，結果見表1。

3.4 其他化合物的鑒定

本實驗從茵陳提取物中鑒定了1個其他類化合物?；衔?在負離子模式下產生準分子離子峰m/z 341.107 1 [M-H]-，由此推斷其分子式為C12H21O11（誤差-2.05）。在進一步的質譜裂解過程中，m/z 341通過丟失1分子葡萄糖殘基產生m/z 179 [M-H-Glu]-，同時產生m/z 161 [179-H₂O]-和m/z 143[179-2H₂O]-等。因此，可將化合物1鑒定為龍膽二糖。

4 討論

本文采用的UHPLC-LTQ-Orbitrap高分辨液質聯用技術在中藥復雜體系物質基礎研究中具有顯著優勢：UHPLC采用亞2 μm顆粒度的色譜柱填料，不僅能獲得更高的柱效，還可在更寬的線速度范圍內保持恒定的柱效，以獲取更好的分離效率、峰容量和靈敏度；LTQ-Orbitrap高分辨液質聯用儀可同時進行多個數據關聯的MS/MS的掃描，能為小分子藥物的鑒定與分析提供了更準確的信息。

本文采用UHPLC-LTQ-Orbitrap高分辨液質聯用技術對茵陳提取物中的化學成分進行分析檢測，結果共篩選鑒定了50個化合物，包括21個黃酮、22個有機酸、6個香豆素以及1個其他類成分。本研究可為下一步的茵陳提取物質量控制、藥理、藥效研究等提供前提與基礎，并為進一步的體內代謝過程以及藥效物質基礎研究提供科學依據。

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[責任編輯 丁廣治]