白術中內酯類成分的TLC鑒別與UPLC含量測定

趙玉嬌+徐文慧+沈小麗+田俊生+秦雪梅

[摘要]建立白術的薄層鑒別與其中3種內酯類成分含量同時測定方法。使用硅膠GF₂₅₄薄層板對白術進行定性鑒別；利用UPLC-PDA梯度洗脫法同時測定白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，選用Waters BEH C₁₈色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動相為乙腈-水，檢測波長235 nm。薄層鑒別特征明顯，專屬性強；含量測定的方法學考察結果符合規定，白術內酯Ⅰ， Ⅱ，Ⅲ線性關系良好（r>0.999 9），平均回收率分別為93.48%（RSD 1.4%）， 94.97%（RSD 1.6%）， 92.71%（RSD 1.2%）。所建立的白術薄層鑒別方法專屬性強、重復性好，3種內酯類成分同時測定方法操作簡單、靈敏度高，兩者結合可以更好的用于白術的質量評價。

[關鍵詞]白術； 白術內酯； 薄層鑒別； 超高效液相色譜； 質量評價

[Abstract]This research is to establish TLC and UPLC methods for simultaneous determination of 3 atractylenolides in Atractylodes macrocephala. Silica gel GF₂₅₄ plate was used for identification of A. macrocephala， and UPLC-PDA gradient elution method was used to simultaneously determine atractylenolide Ⅰ， Ⅱ and Ⅲ. The Waters BEH C₁₈ column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）with acetonitrile-water as mobile phase and the wavelength of UV detector of 235 nm were performed. The quality control study showed that the characteristic for identification by TLC was distinct and highly specific. The method of content determination was in accordance with the regulations. The quantitative evaluation of atractylenolide Ⅰ，Ⅱ and Ⅲ was in good linear range（r>0.999 9）， and the average recovery was 93.48%（RSD 1.4%），94.97%（RSD 1.6%），92.71%（RSD 1.2%），respectively. TLC identification was in good specificity and repeatability， and the UPLC-PDA method for the simultaneous determination of 3 atractylenolides was simple and reliable for the quality control of A.macrocephala.

[Key words]Atractylodes macrocephala； atractylenolide； TLC； UPLC； quality control

白術為菊科植物白術Atractylodes macrocephala Koidz.的根莖，具健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎之功，用于脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲、眩悸、水腫、自汗、胎動不安等癥^[1]。主要化學成分為揮發油，如

蒼術酮、蒼術醇等；內酯類成分，如白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ、雙白術內酯等^[2-4]。2015年版《中國藥典》（一部）白術的質量標準^[5]中，TLC鑒別僅以蒼術酮為指標成分，尚無含量測定項。而蒼術酮是我國傳統中藥白術及蒼術（Rhizoma Atractylodis）等蒼術屬藥用植物揮發油的主要活性成分^[6]，僅用蒼術酮作為白術的鑒別指標不具有專屬性。此外，白術中白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ也為白術的主要活性成分^[7]，但相對蒼術酮來說含量較低，藥典中只用含量較高的蒼術酮作為質量控制指標，不能全面反映白術的質量，因此增加除蒼術酮以外的白術內酯類成分的TLC鑒別及建立相應的含量測定方法，對于提升白術及含白術的成方制劑的質量控制具有重要意義和價值。

關于白術的薄層鑒別，除蒼術酮之外未見有其他成分的研究，本實驗參考其他有關內酯類成分的鑒別研究^[8-9]，根據該類成分的理化性質，增加了以白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ為指標成分并結合蒼術酮的薄層鑒別方法，該方法專屬性強，效果較好。關于白術的含量測定方面，以白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ以及蒼術酮多見，研究多采用GC測定蒼術酮、蒼術醇等揮發性成分的含量^[10-11]，以HPLC測定白術中內酯類成分^[12]，未見有用UPLC在同波長下同時測定白術中白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ和白術內酯Ⅲ含量的分析方法^[13-14]。本文基于UPLC-PDA建立了同時測定白術中白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ含量的分析方法，相對于HPLC具有檢測靈敏度較好，分析周期短、進樣量少和成本節約等特點，為建立全面可控的白術質量評價方法奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀（美國Waters公司，配備Acquity UPLC QSM、Acquity UPLC Sample Manager FTN、Acquity UPLC PDA Detector以及Empower工作站）；CPA 225D型1/10萬電子天平（德國Sartorius公司）；BSA 124S型1/1萬電子天平（德國Sartorius公司）；Milli-Q純水機（Direct 8/16 系統，美國Millipore公司）；KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

白術內酯Ⅰ對照品（純度98%，批號YJ-A3-1160519 ），白術內酯Ⅱ對照品（純度98%，批號YJ-A3-1160519 ），白術內酯Ⅲ對照品（純度98.5%，批號YJ-C1-WG1160520 ），蒼術酮對照品（純度99%，批號YJ-C1-WG1160520），均購自上海永恒生物科技有限公司，硅膠GF₂₅₄薄層板購自青島海洋化工廠。甲醇、磷酸、甲酸、環己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯均為分析純，乙腈為色譜純，水為超純水。

白術樣本隨機購自10家不同的藥房，包括10批生白術和10批炒白術（樣本來源見表1），經山西大學中醫藥現代研究中心秦雪梅教授鑒定為正品，留樣于本中心。

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別實驗方法與結果

2.1.1 對照品溶液的制備

分別取白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ對照品約10 mg，精密稱定，加甲醇溶解，制成質量濃度為1.186，1.270，1.161 g·L^-1的對照品溶液，作為母液；分別精密吸取各母液0.5，0.5，1 mL各定容至10 mL，得59.3，63.5，116.1 mg·L^-1的對照品溶液，備用。取蒼術酮對照品約5 mg，精密稱定，加甲醇溶解，配制成0.577 g·L^-1的對照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備

取過3號篩（80目）的白術粉末0.5 g，加甲醇定容至5 mL量瓶中，稱重，超聲提取50 min，冷卻至室溫，加甲醇補足失重，過濾，取續濾液，作為供試品溶液。

2.1.3 薄層鑒別

照薄層色譜法（2015年版《中國藥典》四部，通則0502）試驗，分別吸取供試品溶液，白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ、蒼術酮對照品溶液各10 μL，分別點于同一硅膠GF₂₅₄薄層板上，以環己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶1∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，再噴以10%硫酸香草醛硫酸溶液，于100 ℃下加熱至斑點清晰，在254 nm紫外燈下檢視，供試品色譜中，在與白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ和白術內酯Ⅲ對照品色譜相應的位置上顯相同顏色熒光斑點，在與蒼術酮對照品色譜相應的位置上顯相同暗紅色斑點。

按照以上鑒別方法，對10批生白術和10批炒白術樣品進行了薄層鑒別試驗，其結果見圖1。

2.2 含量測定實驗方法與結果

2.2.1 對照品溶液的制備

分別精密吸取2.1.1項下各對照品母液0.5，0.5，1 mL定容至10 mL，得59.3，63.5，116.1 mg·L^-1的混合儲備液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

取過3號篩（80目）的白術（BZ6）粉末約0.5 g，置10 mL量瓶中，精密稱定，加入甲醇定容，稱重，超聲50 min，冷卻至室溫，加甲醇補足失重，過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.3 色譜條件及系統適應性試驗

色譜柱：Waters BEH C₁₈柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B）梯度洗脫，0～3 min，10%～20% A，3～7 min，20%～45% A，7～10 min，45%～46% A，10～14 min，46%～48% A，14～17 min，48%～48% A，17～18 min，48%～50% A，18～20 min，50%～53% A，20～22 min，53%～53% A，22～27 min，53%～80%A，27～30 min，80%～88% A，30～33 min，88%～10% A；檢測波長：235 nm；進樣量：2 μL；流速：0.2 mL·min^-1；柱溫：30 ℃。對照品及樣品色譜圖，見圖2，各成分均達到基線分析，白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ和白術內酯Ⅲ的理論塔板數均大于1萬，分離度均大于1.5。

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 線性關系 將2.2.1項下混合儲備液逐級稀釋成系列濃度 （分別為原濃度的1，1/2，1/4，1/6，1/8），分別進樣。以峰面積為縱坐標（Y），濃度為橫坐標（X），進行線性回歸，回歸方程見表2。

2.2.4.2 精密度試驗 精密吸取2.2.2項下白術供試品溶液，連續進樣6次，計算得白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 峰面積的 RSD 分別為 0.60%， 0.40%， 1.4%，表明儀器的精密度良好。

2.2.4.3 穩定性試驗 精密吸取2.2.2項下白術供試品溶液，在 0～24 h內，分別在0， 2， 4， 6， 8， 10， 12， 24 h進樣1次，計算得白術內酯Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ 峰面積的RSD分別為 1.6%， 1.8%， 1.6%，表明供試品溶液中3種成分在24 h內穩定。

2.2.4.4 重復性試驗 取同批白術，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，平行6份，進樣測定。計算得白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 峰面積的RSD分別為0.90%， 1.2%， 1.3%，表明該方法重復性良好。

2.2.4.5 回收率試驗 精密稱取已知白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ含量的同批白術樣品0.5 g，平行9份，各置10 mL量瓶中，平均分為3組，每組分別按白術中白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ含量的50%， 100%， 150% 精密加入質量濃度為1.186， 1.270， 1.161 g·L^-1白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ的母液，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，進樣測定。計算得白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ的加樣回收率分別在90.48%～94.88%， 93.18%～96.79%， 90.96%～95.30%，平均回收率分別為 93.48%， 94.97%， 92.71%，RSD 分別為 1.4%， 1.6%， 1.2%，表明該方法準確度良好。

2.2.4.6 含量測定 取購置的10批生白術和10批炒白術，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，分別進樣測定，結果見表1。

3 討論

3.1 樣品提取方法考察

薄層鑒別實驗中考察了不同提取溶劑，包括正己烷和甲醇，發現甲醇提取效果最佳。含量測定考察了甲醇、乙醇2種提取溶劑，結果發現甲醇提取3種白術內酯的含量最高，故選定甲醇為提取溶劑。同時考察了超聲提取時間，最終確定提取方法為超聲提取50 min效果較好。因此薄層鑒別實驗和含量測定采用相同備樣方法，即甲醇超聲提取50 min。

3.2 薄層鑒別條件優化

本實驗對比了石油醚（60～90 ℃）、環己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯等多種展開劑，分別考察了二相、三相和四相展開系統以及不同展開比例對白術中指標成分的分離效果，結果以環己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶1∶0.1）為展開劑進行薄層鑒別，各指標成分斑點清晰、分離效果最佳。分別考察了薄層板展開過程中溫度和相對濕度對結果的影響，結果表明：溫度為4，15，25，30 ℃時，各指標成分斑點的Rf在較小范圍內波動，但對分離效果幾無影響；相對濕度為32%，52%，75%，83%時，各指標成分斑點的Rf變化極小，不影響分離效果。

3.3 色譜條件優化

實驗中嘗試采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸-水、乙腈-磷酸-水等流動相系統，結果發現使用酸時白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ對照品均發生分解，而采用乙腈-水系統時無分解現象，且白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ的分離度及對稱性均良好，保留時間適中。本實驗中檢測波長的選擇是通過紫外200～400 nm 全掃描，在235 nm 處白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ和白術內酯Ⅲ 3種物質吸收較好，峰型適中，基線平穩，故確定檢測波長為235 nm。

3.4 小結

文獻報道白術揮發油中蒼術酮不穩定，影響其不穩定的主要條件為光照和溫度^[15-16]。蒼術酮在空氣中會氧化產生白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ、表白術內酯I 和雙白術內酯等幾種物質^[17-18]。本實驗過程中也發現了這一現象，蒼術酮對照品溶液在放置一段時間后發生分解，在薄層色譜圖中可看到蒼術酮對照品分解為白術內酯Ⅰ和白術內酯Ⅲ這2種物質見圖1，而關于其轉化的機制有待進一步深入研究。

本實驗在國家藥典的基礎上增加了白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的薄層鑒別方法，使鑒別內容更加全面也更有專屬性；所建立的3種內酯類成分同時測定的UPLC-PDA 方法，經方法學驗證和20批樣品的測定，證明該法操作簡便、靈敏準確，更能客觀、準確的反映白術的質量，有了較為明顯的改進。但本文所用樣本量相對較少，且所選2種不同炮制方法的白術不是同一批次，本實驗只是說明了所建方法的可行性，如果要對比不同炮制品之間的質量差異，還應增加樣本量并使用同批生白術樣本，經過炮制后再比較。

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[責任編輯 丁廣治]