江漢雞蛋殼顏色色素分析及相關基因表達研究

申杰++鄭傳威++潘愛鑾++梁振華++吳艷++杜金平++張昊++蒲躍進++皮勁松

摘要：試驗以白色、粉色、褐色3種蛋殼顏色的雞蛋為研究材料，分析色素在血液和蛋殼上的表現規律，檢測了相關候選基因在雞器官中的表達情況。結果表明，原卟啉含量的不同是造成褐色雞蛋蛋殼顏色深淺不一的主要因素，脾臟可能是蛋殼色素原卟啉形成的重要器官，CPOX和FCEH基因可能是原卟啉形成的關鍵基因，膽綠素沉積的相關有機陰離子轉運家族成員在原卟啉沉積過程中無顯著作用。

關鍵詞：蛋殼顏色；原卟啉；候選基因；江漢雞

中圖分類號：S831 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）03-0508-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.03.029

Study on Pigments of Eggshell Color and Candidate Genes Analysis of Jianghan Chicken

SHEN Jie，ZHENG Chuan-wei，PAN Ai-luan，LIANG Zhen-hua，WU Yan，DU Jin-ping，

ZHANG Hao，PU Yue-jin，PI Jin-song

（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science， Hubei Academy of Agricultural Sciences/The Animal Embryonic Engineering and Molecular Breeding Key Laboratory of Hubei， Wuhan 430064， China）

Abstract： In present study， we used three different types of hens， i.e.， those laying eggs with a white shell， pink shell （generated light-brown eggs）， or brown shell，analyzed the regularity of the pigments between blood and eggshell，detected the expression of candidate genes in the organ of hens. We consider the content of protoporphyrin is the major reason of different eggshell color， a large number of protoporphyrin may produce in spleen. Maybe CPOX gene and FECH gene are the key of the protoporphyrin. But some organic anion transporting polypeptide family members do not have a significant effect as they play in biliverdin deposition.

Key words： eggshell color； protoporphyrin； candidate genes； Jianghan chicken

江漢雞是湖北江漢平原特有的地方品種，具有黃雞的普遍特征，產粉殼或綠殼蛋，受到湖北及周邊省份群眾的廣泛歡迎。消費者對于綠殼和粉殼雞蛋的偏好，使研究雞蛋殼顏色具有重要的經濟意義。眾多的研究表明，造成禽類蛋殼顏色不同的直接原因就是蛋殼表面各種色素的含量不同，這些色素主要是原卟啉、膽綠素和膽綠素的鋅螯合物[1，2]。雞蛋的蛋殼顏色是可遺傳的，且遺傳力較高，一般在0.4左右。雖然遺傳力較高，但不同品種間甚至同一品種不同個體間所呈現的表型變異卻很大[3-6]。

在大多數后生動物中，δ-氨基乙酰丙酸通過高度保守的八步反應合成血紅素，這一過程也稱為謝明氏循環。血紅素生物合成的起始是甘氨酸和琥珀酰輔酶A在5-氨基乙酰丙酸合成酶（ALAS）的作用下合成δ-氨基乙酰丙酸（ALA）；ALA在5-氨基乙酰丙酸聚合酶（ALAD）的作用下聚合形成膽色素原（PBG）；PBG在羥甲基膽素合成酶（HMBS/PBGD）的作用下合成羥甲基膽素（Hydroxymethylbilane）；羥甲基膽素在尿卟啉原Ⅲ合成酶（UROS）作用下合成尿卟啉原Ⅲ（Uroporphyrinogen Ⅲ）；尿卟啉原Ⅲ在尿卟啉原脫羧酶（UROD）作用下生成糞卟啉原Ⅲ（Coproporphyrinogen Ⅲ）；糞卟啉原Ⅲ在糞卟啉原氧化酶（CPOX）作用下合成原卟啉原Ⅸ（Protoporphyrinogen Ⅸ）；原卟啉原Ⅸ在原卟啉原氧化酶（PPOX）作用下生成原卟啉Ⅸ（Protoporphyrin Ⅸ）；原卟啉Ⅸ在亞鐵螯合酶（FECH）的作用下與Fe2+結合最終形成血紅素。在紅細胞分化過程中，CPOX是血紅素形成的限速酶。

研究發現，綠殼蛋雞的蛋殼顏色是由一個主效基因決定的。Punnett等[7]發現并認為雞1號染色體上的一個呈顯性的綠殼基因（Oocyan，O）作用導致了綠色蛋殼。Bartlett等[8]將該基因（O）定位在雞1號染色體的短臂上，發現其與內源病毒因子（ALEV1）以及豆冠位點（P）連鎖，它們之間的遺傳距離分別為1.8 cM（ev1與O之間）和4.1 cM（P與O之間）。Wang等[9]研究發現有機陰離子轉運蛋白家族成員SLCO1B3與膽綠素在蛋殼上的沉積密切相關，SLCO1B3基因就是決定雞產綠殼蛋的關鍵基因。

但是關于褐殼（粉殼）雞蛋的關鍵控制基因的研究較少，尤其地方土雞的蛋殼顏色比褐殼白殼雜交后代更均勻這一現象值得深入探討。為此，本研究在國家產業技術體系的支持下，選擇白來航、江漢雞、洛島紅等蛋雞品種，開展關于江漢雞蛋殼顏色的相關研究，以期為更好地研究蛋殼顏色的形成機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗雞共分3組：白來航蛋雞（白殼蛋）、洛島紅蛋雞（褐殼蛋）、江漢雞（粉殼蛋），每組選取產蛋雞30只。每只蛋雞收集3枚所產蛋，翅靜脈采血1 mL，每1 mL血液用20 U肝素抗凝。每組選取蛋殼顏色均一的3只母雞，屠宰后取子宮內壁組織樣品，于 -80 ℃保存。所有蛋雞均為40周齡，飼養條件良好，無疾病發生，飼料中均未添加色素成分。

1.2 試驗方法

1）雞蛋反光值測定。使用分光測色計測定各組雞蛋的反光值，記錄相關數據。

2）原卟啉與膽綠素標準曲線的制作。取0.36 g原卟啉標準品和0.26 g膽綠素標準品，分別溶于溶解液（V濃鹽酸∶V甲醇=1∶2）中，振蕩混勻，避光溶解12 h，得到標準品原液；將原液倍比稀釋后用紫外分光光度計在412 nm和670 nm處測定各濃度標準品的吸光值，制作原卟啉和膽綠素的標準曲線。

3）蛋殼中色素含量的測定。采用Ito等[10]的方法，蛋殼烘干后取0.25 g溶于溶解液中，靜止溶解12 h，12 000 r/min離心45 min，紫外分光光度計在412 nm和670 nm處測定吸光值，比照標準曲線，獲得蛋殼中原卟啉和膽綠素的含量。

4）紅細胞中游離原卟啉含量的測定。每20 μL抗凝血中添加0.1 mL生理鹽水、4 mL乙酸乙酯-冰醋酸混合液、2.5%硅藻土0.15 mL；將得到的混合液渦旋振蕩至充分混勻；高速離心10 min后取3 mL上清液，加入4 mL 0.5 mol/L的鹽酸，混合5 min后取下層鹽酸溶液，測定吸光度；另取0.03 mL抗凝血測定每個血樣的紅細胞體積；計算每單位紅細胞中游離原卟啉的相對含量。

5）RT-PCR檢測。運用RT-PCR方法檢測血紅素合成通路基因CPOX、FECH和有機陰離子轉運家族SLCO1B3及其同家族基因LOC418189在不同蛋殼顏色蛋雞子宮中的表達情況。

2 結果與分析

從表1可以看出，從表觀上選取的白色、粉色、褐色雞蛋，其蛋殼反光值具有極顯著差異（P<0.01）。蛋殼中色素原卟啉的含量和總量在3種雞蛋中差異顯著（P<0.05），且差異表現為從白殼蛋到褐殼蛋原卟啉含量逐漸增多；白殼蛋蛋殼中膽綠素的含量和總量均顯著低于粉殼蛋和褐殼蛋（P<0.05）；3種顏色蛋殼中色素總量差異極顯著（P<0.01），其差異趨勢表現為色素總含量隨著蛋殼顏色的加深而逐漸增多。白殼蛋雞紅細胞中游離的原卟啉含量極顯著低于粉殼蛋雞和褐殼蛋雞（P<0.01），粉殼蛋雞紅細胞中游離的原卟啉含量與褐殼蛋雞紅細胞中游離的原卟啉含量無顯著差異，但3種蛋雞體內紅細胞中游離的原卟啉含量呈現出隨著蛋殼顏色的加深增多的趨勢。

從表2可以看出，蛋殼的反光值與蛋殼中原卟啉含量、蛋殼中原卟啉總量和色素總量都呈極顯著負相關；反光值與蛋殼中膽綠素含量以及膽綠素的總量無顯著相關性。說明在褐色雞蛋（包括粉色和褐色兩種）中，決定蛋殼顏色的主要色素是原卟啉。

從圖1和圖2可以看出，白殼蛋雞肝臟和脾臟中的CPOX mRNA表達量顯著低于粉殼蛋雞和褐殼蛋雞，CPOX mRNA在3種蛋雞子宮部的表達量差異不顯著。白殼蛋雞脾臟中FECH mRNA的表達量顯著高于其他母雞的脾臟，FECH mRNA在3種蛋雞肝臟和子宮中的表達差異不顯著。CPOX和FECH作為血紅素合成通路的上下游關鍵酶，其在脾臟中的表達結果與蛋殼顏色的變化趨勢相符合，證明了蛋殼表面的色素原卟啉是來自于血紅素合成通路，脾臟可能是作為蛋殼表面原卟啉來源的一個關鍵組織，CPOX和FECH基因可能是原卟啉合成暨導致蛋殼表面顏色差異的關鍵基因。SLCO1B3和LOC418189基因在不同蛋雞的子宮部位不存在明顯的表達差異，對照蛋雞綠殼基因的相關研究結果，認為在膽綠素沉積過程中起關鍵作用的SLCO1B3基因對于原卟啉的沉積不存在積極作用。

3 小結

試驗結果表明，血液是蛋殼中色素的來源之一，但也可能有其他色素來源，且不同蛋雞其色素在細胞內和細胞間轉移過程的不同可能是影響蛋殼色素含量的重要原因。為此，為進一步研究蛋殼顏色提出了兩個假設：①褐殼（粉殼）蛋雞相對于白殼蛋雞，蛋殼色素的主要差異來源于雞體內原卟啉生成量的差異；②原卟啉在蛋殼腺上的沉積與膽綠素不同；③蛋殼表面的原卟啉主要來源可能與脾臟有關，CPOX和FECH基因可作為進一步研究蛋殼顏色的關鍵基因。

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