柿果實水溶性提取物的抗氧化活性研究

王書珍++鄭壯++張志偉++張明菊++李志良++向福++楊谷良

摘要：水果具有加快人體體能恢復、延緩衰老的作用。研究利用DPPH法測定羅田甜柿（Diospyros kaki）果實水溶性提取物的抗氧化能力，經優化的最佳反應條件為40 ℃反應15 min。1 g/mL的柿果實水溶性提取物相當于1.5 mg/mL維生素C的抗氧化效率。對比甜柿果實提取物3種水性溶劑的抗氧化效率，水提取物的抗氧化活性最高，Tris-HCl緩沖液提取物次之，PBS緩沖液提取物抗氧化活性相對較差。

關鍵詞：羅田甜柿（Diospyros kaki）；水溶性提取物；DPPH法；抗氧化活性

中圖分類號：S665.2；R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）03-0542-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.03.038

Study on the Antioxidative Activity of Water-Soluble Extracts from Persimmon Fruit

WANG Shu-zhen，ZHENG Zhuang，ZHANG Zhi-wei，ZHANG Ming-ju，LI Zhi-liang，XIANG Fu，YANG Gu-liang

（Hubei Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement and Resource Comprehensive Utilization/Hubei Collaborative Innovation Center for the Characteristic Resources Exploitation of Dabie Mountains/College of Life Science，Huanggang Normal University，Huanggang 438000，Hubei，China）

Abstract： Fruits play an important part in quickening energy recovery and slowing aging process. the antioxidant capacity of water-soluble extracts from fruits of Diospyros kaki was measured with DPPH method. Results showed that the optimal reaction condition was at 40 ℃ for 15 minutes. The antioxidative capacity of 1 g/mL water-soluble extracts from persimmon fruit was equal to that of 1.5 mg/mL vitamin C. Comparing the antioxidative capacity of H2O，PBS，and Tris-HCl aqueous solvents，the best one was H2O，while the least one was PBS.

Key words： Diospyros kaki； soluble extracts； DPPH method； antioxidative activity

自由基是生物機體氧化反應過程中產生的游離態有害化合物，其氧化活性能夠引起動脈粥樣硬化、心血管疾病、腫瘤等多種慢性疾病[1]。天然抗氧化劑是從動、植物產生的具有抗氧化活性的物質，如多酚類、黃酮類化合物、脂酸等[2]?？寡趸瘎┠苤泻蜕矬w產生自由基，降低自由基對機體傷害的物質，是現代醫藥、食品保健行業研究的重點。

柿（Diospyros kaki）屬柿科（Ebenaceae）柿屬（Diospyros）落葉大喬木，主要分布在熱帶和亞熱帶地區。柿原產于中國，廣泛分布于西北、華南、華北及西南等省區[3]。柿果實具有較高的食用和藥用價值，并且葉、花、皮和根均可入藥，特別是柿葉和柿果實的保健價值引起了人們的重視[4，5]。柿果實營養豐富，除碳水化合物、蛋白質、脂肪、維生素、礦質元素外，還含有大量的氨基酸、萘醌類、黃酮類、萜類、鞣質、谷甾醇類、酚類、香豆素類、有機酸、胡蘿卜素、維生素C等生理活性物質，具有抗菌、抗病毒、消炎、抗過敏、擴張血管等生理功能，柿子單寧能夠有效抑制亞油酸的脂質過氧化過程[6-9]。

本研究對羅田甜柿果實水溶性提取物的抗氧化活性進行研究，探討抗氧化的最優反應條件，為羅田甜柿抗氧化機制的闡述，天然抗氧化劑的開發、應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試驗的羅田甜柿為自然成熟、新鮮無病害的果實，于2013年9月采自湖北省羅田縣，置于自封袋，并放于冰盒中帶回實驗室備用。

1.2 方法

1.2.1 樣品及其處理方法 柿子先后用自來水、滅菌去離子水沖洗干凈，去皮后取食用部分10 g，在研缽中按照1∶5的比例分別加入蒸餾水、PBS（0.1 mmol/L，pH 7.6）、Tris-HCl緩沖液（0.1 mmol/L，pH 7.2），研磨制備均勻液，6 000 r/min低溫離心10 min，留取上清液即為柿果實水溶性活性組分，置于4 ℃冰箱中保存，48 h內用完。

1.2.2 最適濃度的篩選 利用柿果實水提取物進行試驗，總體積為5 mL（2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液+3 mL不同濃度的柿果實水提取物）。6組反應體系內柿果實活性提取物濃度分別為0.015、0.030、0.045、0.060、0.075、0.090 g/mL。同時設置陰性對照組1，反應體系為2 mL DPPH溶液和3 mL滅菌H2O；以及陰性對照組2，反應體系為2 mL無水乙醇和3 mL相應濃度的柿果實水提取物。試驗組和陰性對照組都重復3次。反應體系在37 ℃反應30 min，然后測定517 nm處的吸光度[10]，確定柿果實水提取物的最佳反應濃度。

1.2.3 最適反應溫度的篩選 利用優化出的最佳反應濃度，設置6組相同的反應體系和2個陰性對照，分別在10、20、30、40、50、60 ℃條件下反應30 min，然后測定517 nm處的吸光度，確定柿果實水提取物的最佳反應溫度。

1.2.4 最適反應時間的篩選 利用優化出的最佳反應濃度，設置8組相同的反應體系和2個陰性對照，在最佳反應溫度條件下分別反應5、10、15、20、25、30、35、40 min，統計各反應時間段的自由基清除率，確定最佳反應時間。

1.2.5 最適緩沖液研究 利用蒸餾水、PBS緩沖液、Tris-HCl緩沖液提取的柿果實提取物各3 mL與2 mL的DPPH在40 ℃條件下反應30 min，測定517 nm處的吸光度，確定柿果實提取物自由基清除效率最高的緩沖溶液。

1.2.6 柿果實提取物與維生素C的抗氧化活性比較 將0.066 7 g/mL的柿子果實提取物3 mL與 2 mL的0.2 mmol/L的DPPH在40 ℃反應15 min，統計自由基清除率。配制濃度為2 mg/mL的維生素C溶液，按照5 mL的反應體系設置4組試驗，維生素C的終濃度分別為0.100 0、0.010 0、0.005 0、0.002 5 mg/mL，40 ℃反應15 min，計算維生素C的自由基清除效率，并與柿果實提取物對DPPH自由基清除率進行比較。

2 結果與分析

2.1 最適濃度的篩選

在對DPPH自由基的清除過程中，隨著柿果實水溶性提取物濃度的增高，自由基清除率逐漸提高，即抗氧化能力是濃度依賴性方式進行的（圖1）。在0.015 g/mL處理組內，自由基清除率僅46.11%。0.030 g/mL和0.045 g/mL處理組內的自由基清除率分別是55.99%和65.57%。當柿果實提取物濃度增大到0.060 g/mL時，自由基清除率達到73.63%，比0.045 g/mL處理組自由基清除率增加了12.29%。然而，當濃度再增加到0.075 g/mL和0.090 g/mL時，自由基清除率增幅較小，分別為79.63%和82.15%。

當反應濃度從0.060 g/mL再增加時，反應進入平臺期，自由基清除率雖然也在增高，但是增幅降低。在6組濃度不同的試驗組內，以0.060 g/mL的反應體系效率最高，因此在后續的酶學參數分析中，以濃度為0.060 g/mL的柿果實提取物溶液作為檢測標準。

2.2 最適反應溫度的篩選

在柿果實濃度一致的情況下，隨著反應溫度的不同，自由基清除率隨之而變化（圖2）。在溫度為10～40 ℃，隨著溫度的升高，體系的吸光度降低，自由基清除效率逐漸提高。在40～60 ℃的溫度區間內，溫度升高，反應體系的吸光度有所升高，即自由基清除效率逐漸降低。反應溫度為40 ℃左右時，柿水溶性提取物具有相對于其他反應溫度較高的清除DPPH自由基的能力，即抗氧化能力以40 ℃左右最強。

2.3 最適反應時間的篩選

在柿果實提取物濃度和反應溫度相同的條件下，隨著反應進程的進行，檢測自由基清除率的變化（圖3）。在反應時間為5～15 min隨著反應時間的延長，反應體系的吸光度降低，自由基清除率逐漸增高。在15～40 min反應時間內，反應時間延長，反應體系的吸光度基本不變，自由基清除率維持在84.5%左右。即在15 min的反應時間內，柿果實的提取物的抗氧化能力最強。繼續延長反應時間，對自由基的清除效率保持不變。因此，柿果實的抗氧化反應在15 min時間內效果最好。

2.4 緩沖液對自由基清除率的影響

在Tris-HCl緩沖液、蒸餾水、PBS緩沖液作為提取液時，水提取物的自由基清除效率最高，達到83.39%（圖4）。自由基清除效率最差的提取液為PBS緩沖液，僅為33.73%。Tris-HCl作為提取液時DPPH自由基清除率為55.89%，比水提取液低，但是高于PBS緩沖液。濃度為1 g/mL的柿果實水溶性提取物的自由基清除率相當于質量濃度1.5 mg/mL維生素C的自由基清除率，即抗氧化能力相當。

3 討論

楊繼濤等[11]把柿果實中抗氧化物質進行了成分分析以及含量測定，對不同基因型柿果實中抗氧化物成分進行測定，包括總酚、總黃酮、總黃烷醇及VC等，發現不同基因型柿果實之間總酚、總黃酮、總黃烷醇及VC含量區別很大，野生種君遷子的總酚、總黃酮、總黃烷醇及VC含量明顯高于栽培種的含量，并且抗氧化活性物質總酚、總黃酮及總黃烷醇的含量與抗氧化能力間的相關性均達到顯著性差異（TBARS和HRSA除外），并認為柿果實中所含有的多酚類物質是柿果實抗氧化作用的重要因子之一。

2，4-二硝基苯肼和DPPH均為測定醛、酮類的顯色劑，二者都可以用來評價抗氧化能力。郭豫等[12]曾用改良過的2，4-二硝基苯肼比色法來評價抗氧化保健食品中蛋白質羰基含量。本次試驗用DPPH對柿果實水溶性提取物的抗氧化活性進行了定性分析，對其最佳反應條件進行了篩選，發現柿果實水溶性提取物具有較好地清除DPPH自由基能力，其達到最大抗氧化活性的反應溫度為40 ℃，反應時間為15 min，這一情況與張惠婷等[13]的研究也比較符合。

柿子營養豐富，含有大量的糖類、多種維生素，具有較高的藥用價值和經濟價值。在甜柿功能產品開發方面，林嬌芬等[14]、周鑫堂等[15]研究發現柿葉具有抗氧化、降糖、抗腫瘤、調血脂、止血等藥理作用。關于柿皮，王繼之[16]對其中的有效成分進行提取，而陳湘寧等[17]將柿皮與柿肉中抗氧化活性物質進行了研究與對比。本研究可為柿子抗氧化分子機制研究提供理論依據，也為改善柿子品種特質，開發柿子相關的功能食品提供參考。

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