17味中藥對豚鼠皮膚酪氨酸酶mRNA表達水平與致色素作用的影響

姜麗莎，張曉東，張國斌，王恩波

17味中藥對豚鼠皮膚酪氨酸酶mRNA表達水平與致色素作用的影響

姜麗莎1，張曉東2，張國斌2，王恩波2

（1.章丘市人民醫院 山東 濟南 250200；2.解放軍第202醫院 遼寧 沈陽 110003）

目的：探討17味中藥對豚鼠皮膚中酪氨酸酶mRNA的調節與致色素作用。方法：以棕黃色豚鼠為實驗模型，17味中藥的75%乙醇提取液為實驗組，8-甲氧補骨脂素（8-methoxypsoralan，8-MOP）為陽性對照組、75%乙醇為陰性對照組，均涂于豚鼠皮膚上，40d后取皮膚標本免疫組化染色，測平均灰度值與黑素細胞數目，比較其作用結果。結果：白芷、當歸、甘草、枸杞、旱蓮草、紅花、女貞子、桑椹、沙參、沙苑子、首烏、菟絲子、黑芝麻、梔子等14味中藥均可不同程度上調酪氨酸酶mRNA表達水平并促進黑素細胞增殖及黑素生成；合歡與益母草可促進黑素生成增加，但無明顯上調酪氨酸酶mRNA表達水平的作用；黃芪則無明顯上調酪氨酸酶mRNA表達水平、促進黑素細胞增殖及黑素生成的作用。結論：通過本研究表明部分中藥可上調酪氨酸酶基因表達水平并促進黑素生成，為臨床治療白癜風優化組方提供實驗依據。

中藥；白癜風；酪氨酸酶mRNA；致色素；豚鼠

白癜風（Vitiligo）是一種原發性的、局限性或泛發性的皮膚黏膜色素脫失癥。一般認為其發病是在多種內外因子的激發下，導致酶系統的抑制或黑素細胞的破壞或使黑素體的生成或黑化障礙，致使色素脫失[1]。黑素細胞是皮膚里的特殊細胞，可以產生黑色素，黑素小體是合成和儲存和色素的亞細胞結構，黑素小體的生成或轉運異常與白癜風等色素障礙性疾病的發病機理有密切聯系[2]，酪氨酸酶在黑素小體的生成中起著重要的調控作用[3-5]。酪氨酸酶是黑素合成途徑中的關鍵酶[6]，與酪氨酸酶mRNA的表達與調控有直接關系，酪氨酸酶活性的改變可引起白癜風等色素障礙性皮膚病[7]。

中醫藥治療白癜風有悠久的歷史，我們依據中醫疏肝解郁、活血祛風辨證理論為法則組方，配制成紅花復方制劑應用于臨床，療效尚佳[8]?，F選取復方制劑中17味中藥的乙醇提取液為制劑，以棕色豚鼠為動物模型，采用酪氨酸酶mRNA原位雜交方法，觀察中藥對豚鼠皮膚組織中酪氨酸酶基因表達水平的影響，同時用Fontana-Masson法染色觀察中藥的致色素作用，為治療白癜風最佳組方提供可靠的實驗數據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：棕黃色豚鼠24只（遼寧長生生物技術有限公司），質量350g左右，雌雄各半兼用。

1.1.2 試劑：0.1%8-甲氧補骨脂素(8-MOP)-甲氧沙林（重慶華邦制藥有限公司,國家準字號H50021839），酪氨酸酶mRNA原位雜交試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司），DAB顯色試劑盒（中衫生物技術有限公司）。

1.1.3 主要儀器：中藥粉碎機（ST-10B，永康市帥通工具有限公司），電子稱（BS124S，德國賽多利斯集團），超聲機（KQ-400DB，昆山市超聲儀器有限公司），自動組織脫水機、烤片機、生物組織包埋冷凍機（天津天利航空機電有限公司），共覽顯微鏡（DMD108），電熱恒溫培養箱（上海新苗醫療器械制造有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備：黃芪、當歸、白芷、女貞子、枸杞、菟絲子、沙苑子、旱蓮草、首烏、沙參、黑芝麻、黑桑葚、益母草、甘草、合歡皮、紅花、梔子17味中藥，80℃烘干粉碎，20目篩出并取粗粉10g,分別用75%乙醇100ml，室溫密閉浸泡24h，超聲提取2h，濾過，即得濃度為0.1g/ml的中藥提取液,于4℃冰箱中保存備用。

1.2.2 實驗分組：實驗分中藥實驗組，8-MOP陽性對照組，75%乙醇陰性對照組。采用隨機數字法將中藥分成4組，Ⅰ組：女貞子、旱蓮草、梔子、枸杞；Ⅱ組：甘草、首烏、黃芪、黑桑葚；Ⅲ組：白芷、當歸、紅花、合歡皮；Ⅳ組：黑芝麻、菟絲子、沙參、益母草、沙苑子。

取豚鼠24只，隨機分4組，每組6只。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組各實驗動物背部取6個3cm×3cm相隔離區域剪毛，Ⅳ組各實驗動物背部取7個3cm×3cm相隔離區域剪毛，暴露皮膚，以便涂擦藥物。外用中藥提取液分別涂擦每個隔離脫毛區，四組豚鼠分別涂Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組中藥，并每只均涂8-MOP與75%乙醇做陽性、陰性對照。涂豚鼠脫毛區，每次用0.5ml，2次/d，連續40d。在涂藥時要反復擦，盡量使之滲透。各組涂藥后1h，日光燈照射15min（功率40W×10，距離30cm）。每組豚鼠每3d脫毛一次。

1.2.3 取材：末次給藥后1h，實驗動物20%烏拉坦麻醉(0.5ml/100g)，用藥部位中心取1cm×1cm皮膚。皮膚標本給予10%甲醛固定石蠟包埋。

1.3 結果測定及判定

1.3.1 酪氨酸酶mRNA原位雜交：測定酪氨酸酶mRNA水平按試劑盒說明操作。在高倍鏡視野下觀察各組的原位雜交切片和相應的背景對照切片，計數在高倍鏡下每100個基底層細胞中胞漿呈棕黃色的細胞數并拍照。每張切片隨機選擇10個視野，應用Image-Pro Plus 6.0軟件處理系統測定其灰度值。

1.3.2 黑素顆粒染色：Fontana-Masson染色步驟：切片脫蠟水化，將切片置入Fontana硝酸銀溶液，37℃孵箱中2h，蒸餾水洗3次，VG液對比染色2min后，蒸餾水沖洗、脫水，封片觀察色素分布情況。隨機選擇6個高倍視野（×400），共36個視野，測量每視野下基底層和基底上層中周圍環繞色素的細胞比（定義為陽性細胞），陽性細胞≤5%為陰性，記為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，≥50%為3分，≥75%為4分。

1.4 統計學方法：實驗數據用（xˉ±s）表示，應用SPSS17.0軟件處理系統進行數據的統計，計量資料采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 酪氨酸酶mRNA陽性細胞主要分布于表皮基底層、棘層、顆粒層,少數陽性細胞分布在真皮淺層,中藥組較乙醇對照組明顯增多,與8-MOP組無明顯差異（圖1～3）；正常豚鼠皮膚黑色素分布于基底層、棘層和顆粒層，呈黑色顆粒狀，中藥組表皮基底層中黑素顆粒連續，幾乎布滿表皮全層，較乙醇對照組明顯增多,與8-MOP組無明顯差異（圖4～6）。

2.2 17味中藥對酪氨酸酶mRNA的影響（見表1）。

2.2.1 促進酪氨酸酶mRNA雜交細胞數目及灰度值上升：白芷、當歸、甘草、枸杞、旱蓮草、紅花、女貞子、桑椹、沙參、沙苑子、首烏、菟絲子、黑芝麻、梔子與75%乙醇對照組比較，差異顯著，P＜0.05。

2.2.2 對酪氨酸酶mRNA雜交細胞數目及灰度值無影響：合歡、黃芪、益母草與75%乙醇對照組比較，無顯著差異，P＞0.05。

2.3 17味中藥對色素影響（見表1）。

2.3.1 促進黑色素增多：白芷、當歸、甘草、枸杞、旱蓮草、合歡、紅花、女貞子、桑椹、沙參、沙苑子、首烏、菟絲子、益母草、黑芝麻、梔子與75%乙醇對照組比較，差異顯著，P＜0.05。

2.3.2 對黑色素無影響：黃芪與75%乙醇對照組比較，無顯著差異，P＞0.05。

表1 17味中藥對酪氨酸酶mRNA在豚鼠皮膚中的表達及致色素作用（xˉ±s）

圖1 乙醇組豚鼠皮膚酪氨酸酶表達（免疫組化染色×400）

圖2 8-MOP組豚鼠皮膚酪氨酸酶表達（免疫組化染色×400）

圖3 中藥（黑芝麻）組豚鼠皮膚酪氨酸酶表達（免疫組化染色×400）

圖4 乙醇組豚鼠皮膚黑素顆粒表達（Fontana-Masson染色×400）

圖5 8-MOP組豚鼠皮膚黑素顆粒表達（Fontana-Masson染色×400）

圖6 中藥（黑芝麻）組豚鼠皮膚黑素顆粒表達（Fontana-Masson染色×400）

3 討論

白癜風是一種常見的色素脫失性皮膚病，皮損處黑素的生成明顯減少或消失。酪氨酸酶是皮膚黑素生物合成的主要限速酶，決定黑素合成的速率，其活性與黑素合成量相關[9]。它的表達與其mRNA表達與調控有直接的關系，酪氨酸酶活性的改變可引起白癜風等色素障礙性皮膚病[10-11]。

中藥治療白癜風的療效是肯定的[12]，但是中藥的作用機制有待進一步研究。李洪武等[13-14]研究表明中藥赤芍、菟絲子可在轉錄水平上調酪氨酸酶基因表達水平，誘導皮膚黑素生成，證明部分中藥對治療白癜風有重要意義。本實驗為了探討中藥治療白癜風的作用機理，選用棕色豚鼠作為動物模型，采用原位雜交方法檢測了17味中藥對酪氨酸酶mRNA基因表達的影響，同時應用Fontana-Masson染色觀察其對豚鼠皮膚致色素作用，實驗結果顯示：①白芷、當歸、甘草、枸杞、旱蓮草、紅花、女貞子、桑椹、沙參、沙苑子、首烏、菟絲子、黑芝麻、梔子等14味中藥均可不同程度地上調酪氨酸酶mRNA表達水平并促進黑素細胞的增殖及黑素生成；②合歡、益母草有促進黑素生成增加的作用，但無明顯上調酪氨酸酶mRNA的表達水平；③黃芪無明顯上調酪氨酸酶mRNA表達水平、促進黑素細胞的增殖及黑素生成的作用。本實驗中17味中藥促進酪氨酸酶mRNA表達水平、黑素細胞的增殖及黑素的生成作用不完全平行，提示中藥促進黑素生成不限于激活酪氨酸酶，可能還與轉錄水平后其他促黑素細胞增殖因素有關，黑素合成的可在黑素合成相關酶類基因的轉錄和活化、黑素小體的合成及轉運、黑素的分布與降解等不同的途徑上進行[15]，中藥的作用機制尚待進一步研究。本研究通過檢測中藥對豚鼠皮膚酪氨酸酶mRNA水平的表達和致色素作用的影響，有助于說明中藥在轉錄水平治療白癜風等色素脫失性疾病的機理，為臨床用藥提供參考資料，并為開發治療白癜風等色素脫失性疾病的藥物提供線索，部分中藥在治療白癜風的其他機制有待進一步研究。

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Effects of Ethanol Extracts from 17 Traditional Chinese Medicine (TCM) on the mRNA Level of Guinea Pig’s Tyrosinase and Melanogenesis

JIANG Li-sha1,ZHANG Xiao-dong2, ZHANG Guo-bin2, WANG En-bo2
(1.Zhangqiu People's Hospital,Jinan 250200,Shandong,China; 2.The 202 Military Medical University of Chinese PLA,Shenyang 110003,Liaoning,China)

ObjectiveTo explore the effects of 17 traditional Chinese medicine (TCM) on the expression of Tyrosinase mRNA gene and melanogenesis from skin of guinea pigs.MethodsThe brown guinea pigs used as the experimental model,ethanol extracts obtained from 17TCM as the experimental group,8- Methoxypsoralen (8-MOP) as positive control group,75% ethanol as the negative control group,coated on the skin of guinea pigs,40 days later cut of sample skin and process it with immunohistochemical staining,measured the mean gray value and the number of melanocytes, and compared the results.ResultsThe 14 kinds of TCM such as Angelica dahurica,Angelica sinensis, Licorice,Chinese wolfberry, Eclipta, Safflower,Privet fruit,Mulberry,Adenophora stricta,Astragalus complanatus, Polygonum multiflorum, Dodder,Black sesame,Gardenia could upregulate the gene expression of tyrosinase mRNA and enhance the melanogenesis and promote the proliferation of melanocytes in different degrees.Acacia and Motherwort could promote melanogenesis increased,but no significant effect on tyrosinase mRNA expression;There is no effect of Astragalus.ConclusionThis study showed that some TCM can increase tyrosinase gene expression and promote melanogenesis,which provide scientific basis for optimal prescriptions in the treatment of vitiligo.

Traditional Chinese Medicine (TCM); Vitiligo; Tyrosinase mRNA; Cause pigment; Guinea pigs

Q591.3 R758.4+1

A

1008-6455（2017）02-0073-03

2016-10-23

2017-01-26

編輯/張惠娟

遼寧省自然科學基金（201102231）

張曉東，主任醫師，中藥治療白癜風的機制研究，沈陽202醫院皮膚科，110000；E-mail:zhangxiaodong_202@163.com