太子參玉米黃質環氧化酶基因的克隆與表達分析

鄭偉+周濤+李軍+龍登凱+江維克+丁鈴

[摘要] 玉米黃質環氧化酶（zeaxanthin epoxidase，ZEP）在植物脫落酸（abscisic acid，ABA）生物合成間接途徑中發揮著重要調節作用。該研究根據太子參轉錄組數據，克隆獲得太子參的Pseudostellaria heterophylla玉米黃質環氧化酶基因，命名PhZEP。對其序列進行生物信息學分析，結果表明PhZEP的開放閱讀框（open reading frame，ORF）為1 263 bp，編碼420個氨基酸，預測其蛋白的相對分子質量為47.34 kDa，等電點（theoretical pI）為6.64；具有脂質蛋白附著點和黃素蛋白單加氧酶的特征性結構域，且在N端含有分泌信號肽。實時熒光PCR分析發現，PhZEP在葉片中表達量最高，其次是莖和須根；PhZEP在盛花期后10，40 d塊根中的表達量較高；ABA處理后PhZEP表達量與對照組相當，經氟啶酮處理后PhZEP的表達量顯著高于對照組。該研究從太子參中分離鑒定了ZEP基因，對后續研究其基因的功能特點和解析ABA在太子參生長發育過程的遺傳調控提供研究基礎。

[關鍵詞] 太子參； 玉米黃質環氧化酶； 克??； 表達分析

[Abstract] Zeaxanthin epoxidase plays an important role in indirect pathway of plant abscisic acid biosynthesis. According to the data of Pseudostellaria heterophylla transcriptome， zeaxanthin epoxidase gene was isolated and named as PhZEP. The results of bioinformatics analysis showed that the coding sequence of PhZEP was 1 263 bp long and encoded 420 amino acids. The putative protein molecular weight was 47.34 kDa and its theoretical isoelectric point was 6.64. The characteristic structure domains were predicted， including binding site of lipoprotein and flavoprotein monooxyenase. A signal peptide was discovered at the N-terminal of amino acids. The Real-time PCR revealed that PhZEP had a higher expression level in leaves than other tissues of P.heterophylla. Highly expressed PhZEP was also observed at 10 d and 40 d tuberous root after flowering. PhZEP presented a different expression after treatment with ABA， fluridone and ABA +fluridone compared to the control. The expression of PhZEP in tuberous root after ABA treatment was close to that in control group， while PhZEP showed significant up-regulation in the fluridone treatment group. In this study， the PhZEP gene from P. heterophylla was cloned and this result has important significance for its functional identification. This research provides a basis for the further analysis on functional mechanism of ABA during development of P. heterophylla.

[Key words] Pseudostellaria heterophylla； zeaxanthin epoxidase； cloning； expression analysis

太子參為石竹科植物孩兒參Pseudostellaria heterophylla （Miq.） Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根，是我國傳統的常用補益中藥，具有益氣健脾、生津潤肺的功效。近年來，太子參的開發利用從臨床藥品不斷延伸到功能性食品和化妝品。太子參塊根的生長發育情況是直接影響藥材的產量與品質的關鍵因素[1]，植物塊根的形成和發育受多種因素影響，其中內源激素的調控是主要因素之一[2-3]。研究認為，脫落酸（abscisic acid，ABA）、細胞分裂素（cytokinin，CTK）、生長素（indole-3-acetic acid，IAA）等激素均有利于塊根的膨大[4-6]。

ABA不僅在植物根的生長、塊根類作物的物質運輸以及種子休眠、果實成熟等生長發育過程中具有關鍵的調節作用，同時對植物干旱、低溫等脅迫環境下的生理活動同樣起著重要作用[7-8]。植物體內ABA的生物合成途徑一般包括2種：C15直接途徑和C40間接途徑，高等植物主要以C40間接途徑為主。在C40間接途徑合成ABA的過程中，首先是C40類胡蘿卜素的玉米黃素經過2次環氧化作用形成紫黃質，參與該步反應的關鍵調控酶基因是玉米黃素環氧化酶（zeaxanthin epoxidase，ZEP）基因[9]。ZEP基因除了在ABA生物合成途徑中發揮著重要作用外，還在葉片、莖等葉綠體含量比較豐富的組織中參與植物的葉黃素循環[10]。Audran等[11]研究發現ZEP基因在植物的各組織均存在表達，但在不同組織中的表達具有顯著性差異，當受到干旱脅迫誘導時，葉片和根中的ABA含量出現同時增加，對應的ZEP基因的轉錄水平只在根中增加，而葉片中轉錄水平受晝夜節律的調控呈周期性變化。因此，陶均等[12]認為ZEP基因可能不是參與ABA生物合成途徑中的關鍵酶基因。

本研究根據課題組前期構建的太子參轉錄組數據結合生物信息學分析，檢索ABA合成相關的ZEP基因，采用PCR方法擴增ZEP基因的全長CDS序列，對所獲得基因序列進行生物信息學分析，同時對ZEP基因在太子參的不同組織、不同生長發育時期以及ABA和氟啶酮（fluridone）處理后塊根中的表達模式進行檢測。為研究ZEP基因在藥用植物太子參中ABA的合成途徑中扮演著怎樣的功能對進一步研究太子參塊根發育過程的調控機制奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品 研究所用材料有2類，一是貴州施秉本地種源采收期的太子參的莖、葉、塊根和須根，樣品采集后存于自封袋中帶回實驗室，將樣品表面泥土沖洗干凈，及時將塊根分成韌皮部和木質部，分別置于10 mL離心管中，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存備用。二是選取長勢健壯一致的太子參幼苗采挖后帶回實驗室，盆栽置混合土中（普通土-營養土-珍珠巖-蛭石 3∶3∶1∶1），實驗組分別采用200 mL的15 mg·L-1ABA，30 mg·L-1氟啶酮和ABA+氟啶酮溶液（等體積混合溶液）對不同盆栽太子參進行灌根，對照組噴施等量的清水，其中對照組分別采收盛花期后10，20，30，40，50，60 d（成熟期）的太子參塊根，實驗組則在60 d（成熟期）采收太子參塊根。每次取大小均勻的塊根經液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 太子參總RNA提取、純化與cDNA合成 取-80 ℃保存的太子參樣品適量，于預冷的研缽中，加液氮，迅速研磨成粉末狀，按RNAiso Plus試劑盒（TaKaRa，大連）操作說明提取總RNA。經DNase I（TaKaRa，大連）純化后，用50 μL DEPC水溶解RNA，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，Nanodrop 2000核酸定量儀檢測RNA的濃度和純度。再按反轉錄酶M-MLV試劑盒（TaKaRa，大連）操作，將已純化的總RNA分別反轉錄合成第一鏈cDNA，-20 ℃保存備用。

1.3 PhZEP基因的分離鑒定與克隆 從美國國立生物技術信息中心（NCBI）下載擬南芥Arabidopsis thaliana、水稻Oryza sativa等模式植物的玉米黃質環氧化酶基因，構建本地Blast檢索太子參轉錄組數據庫，期望值為E-20。將獲得的候選基因在NCBI中進行比對分析，得到1條太子參的玉米黃質環氧化酶基因。通過NCBI數據庫中ORF Finder查找太子參ZEP基因的開放閱讀框（open readingframe，ORF），根據所得ZEP基因的CDS序列的信息，利用Primer Premier 5軟件設計CDS序列的全長引物PhZEP-F：5′-ATAGTAGGAGGGAGTATAGCTGGTG-3′，PhZEP-R：5′-TTAACTCATCAGCAACTCGGGTTTG-3′。以太子參塊根木質部總RNA的反轉錄第一鏈cDNA為模板，進行PCR擴增，擴增體系為0.125 μL TaKaRa Ex Taq （5 U·μL-1），2.5 μL 10×Ex Taq Buffer （Mg2+Plus），2 μL dNTP Mixture （2.5 mmol·L-1），PhZEP-F/R （10 μmol·L-1）各1 μL，1 μL cDNA模板，ddH2O補足至25 μL。反應程序為95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個循環；72 ℃ 7 min，4 ℃保溫。

PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠目的條帶，采用Omega膠回收試劑盒回收。取4 μL回收的PCR產物，5 μL連接緩沖液，與1 μL克隆載體pMD19-T（TaKaRa，大連）進行連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞中，挑選陽性克隆送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.4 PhZEP編碼蛋白的生物信息學分析測序結果 用Genetyx version 7軟件去掉載體序列，通過Sequencher 4.2軟件與PhZEP的預測序列進行比對分析后采用DNAman軟件翻譯為氨基酸序列。使用在線工具ORF Finder （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）查找ORF。用NCBI中Blastp工具對所獲得的編碼區序列進行初步同源比對分析，并通過Conserved Domains （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和InterProScan （http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）對結構域進行預測分析。運用在線工具Protparam （http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html），SignalP 4.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），TMHMM Server v2.0 （http：//www.Cbs.dtu.dk/services/TMHMM/），TargetP1.1 server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）依次對PhZEP蛋白的理化性質、信號肽、跨膜區域和亞細胞定位進行預測分析。采用Muscle 3.6軟件對PhZEP與其他13種植物的ZEP氨基酸進行序列比對分析，比對結果通過MEGA 6.0軟件采用鄰接法（neighbor-joining method，NJ）構建系統發育樹。

1.5 實時熒光定量PCR（real-time PCR） 根據獲得的PhZEP基因的全長CDS序列，利用軟件Primer Premier 5設計熒光定量PCR特異性引物PhqZEP-F：5′-AGCACATTGACAAGGGATGA-3′，PhqZEP-R：5′-TGATGAGCCCACATGAAGAT-3′，以1.2項下獲得的cDNA為模板，太子參PhACT2 （gi： KT363848）為內參基因，在ABI 7500 實時熒光定量PCR儀進行擴增，對PhZEP基因在太子參的不同組織、不同生長發育時期以及ABA和氟啶酮處理后塊根中的表達模式進行檢測。實時熒光定量分析試劑盒為GoTaq qPCRMaster Mix（TaKaRa，大連）。PCR擴增體系為2 × GoTaq qPCR Master Mix 10 μL，PhqZEP-F/R （5 μmol·L-1）各0.8 μL，cDNA模板2 μL，加Nuclease-Free Water 補足至終體積20 μL。每個反應重復3次。擴增程序為95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環，溶解曲線為95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。根據ABI 7500 Real Time PCR System自帶軟件的分析方法，用2–ΔΔCt法對PhZEP基因的表達情況進行分析。

2 結果與分析

2.1 太子參PhZEP基因的克隆 通過太子參轉錄組數據庫得到1條ZEP基因的轉錄本序列，長1 833 bp，包含1個1 263 bp的ORF，編碼420個氨基酸，1～104 bp為5′非編碼序列（5′UTR），1 368～1 833 bp為3′UTR。利用其全長CDS序列的特異引物PhZEP-F與PhZEP-R，以太子參塊根木質部cDNA為模板，經RT-PCR擴增、克隆和測序分析得到1條大小為1 263 bp的片段，與預測結果一致，見圖1。

2.2 太子參PhZEP基因的序列分析 通過Protparam預測結果顯示PhZEP蛋白的分子式為C2107H3305N581O624S18，相對分子質量為47.34 kDa，等電點pI 6.64。不穩定系數為44.87，脂肪系數為84.95，平均親水性系數為0.329，說明PhZEP基因編碼蛋白是親水性蛋白。同源性比對分析發現，該基因與甜菜（Beta vulgaris subsp. vulgaris，XP_010670730.1）的ZEP序列相似性最高，達73%。PhZEP基因的結構域屬于NADB_Rossmann超家族成員，含有玉米黃質環氧化酶的特征性結構域，分別是1個脂質蛋白附著點區域（prokaryotic membrane lipoprotein lipid attachment site profile，PS51257）位于1～19個氨基酸，4個黃素蛋白單加氧酶區域（flavoprotein monooxyenase，PR00420）位于6～28，158～173，307～338，357～373個氨基酸，FAD結合區域（FAD binding domain，PF01494）位于6～373個氨基酸，見圖2。

黑色框.脂質蛋白附著點區域；紅色框.起始密碼子和終止密碼子；黑色線.黃素蛋白單加氧酶區域；紅色線.FAD結合區域。

運用SignalP4.1檢測到第1～29個氨基酸存在1段信號肽，序列為MKREKKAIIVGGSIAGVSCAHALTTAGWQ，且S平均值大于0.5，推測PhZEP蛋白為分泌蛋白，這與TargetP1.1的亞細胞定位預測結果一致，見圖3。SOPMA預測顯示，PhZEP蛋白的二級結構中，無規則卷曲（random coil）占36.67%，α-螺旋（alpha helix）占30%，延伸鏈（extended strand）占23.33%，β-轉角（beta turn）占10%，可見無規則卷曲和α-螺旋為二級結構的主要元件，散布于整個PhZEP蛋白中，見圖4。

2.3 太子參PhZEP基因的系統進化分析 為分析PhZEP蛋白的進化情況，從NCBI中下載具有代表性的擬南芥A. thaliana、玉米Zea mays、煙草N. plumbaginifaolia、水稻O. sativa、甜菜B. vulgaris subsp. vulgaris等13種植物的ZEP氨基酸序列。將以上ZEP蛋白序列與PhZEP蛋白的氨基酸序列應用Clustal W軟件比對分析，再采用MEGA 6.0軟件中的鄰接法構建ZEP進化樹，進行聚類分析。結果

顯示，太子參PhZEP只與甜菜ZEP聚為一類，同時在NCBI Blastp同源比對分析中親緣關系也最近?？赡苁翘訁⑴c甜菜均為石竹目植物，說明石竹目植物的ZEP與其他物種類群的ZEP可能存在功能差異，見圖5。

2.4 太子參PhZEP基因在不同組織、不同生長發育時期以及ABA和氟啶酮（fluridone）處理后塊根中的表達分析 實時熒光定量PCR分析結果表明，PhZEP基因在太子參5個組織中的表達存在差異，葉片中表達水平最高，莖與須根的表達量次之，塊根的木質部和韌皮部最低，見圖6；PhZEP基因在太子參不同生長發育的表達量呈現先下降后上升，再下降，其中盛花期后10，40 d的表達量較高，見圖7；外源ABA、氟啶酮和ABA+氟啶酮處理后，太子參PhZEP基因的表達量為氟啶酮組>ABA+氟啶酮組>ABA組>對照組，見圖8。

3 討論

ABA合成途徑中存在3個關鍵調節位點，對應3個調控酶，其中的ZEP是ABA合成途徑中第一步反應的調控酶，也是一種雙功能單加氧酶，屬于脂質運載蛋白家族，定位于葉綠體內囊體膜上，具有保護葉綠體的作用[9，13]。本研究從太子參中成功克隆的1個PhZEP基因，編碼420個

氨基酸的蛋白質，其中1～19個氨基酸是脂質蛋白附著點，表明PhZEP蛋白也是脂質運載蛋白家族的成員，并且具有4個單加氧酶的結構域，該結構域是ZEP特有，是重要的催化位點[13]，因此推測太子參PhZEP基因屬于ZEP基因家族的成員。

植物的基因表達具有組織特異性，這種特性與基因的功能特點等密切相關。本研究表明，太子參PhZEP基因在葉片、莖、須根、塊根木質部和韌皮部均有表達，并具有特異性，與煙草ABA2[11]、番茄NpZEP[14]的表達模式相似，均在葉片中的表達水平最高，在莖次之，根等部位的表達量較少。葉片和莖是含葉綠體比較豐富的部位，ZEP基因在這2個部分的表達量顯著高于其他部位，可能與ZEP定位于葉綠體中有關，也可能是ZEP基因具有保護葉綠體免受光氧化破壞的作用。蛋白質N端的轉運肽序列有助于蛋白質從細胞質基質轉運到葉綠體[15]。但本研究顯示太子參ZEP蛋白N端不具有轉運肽序列，而是分泌通路信號肽序列，與PhZEP基因在葉片等器官中高量表達矛盾，說明PhZEP基因可能并未參與太子參葉黃素循環，葉黃素循環可能由ZEP基因家族的其他成員完成。

ABA是調控植物塊根或塊莖生長發育的關鍵激素，在不定根的形成、塊根的膨大等過程具有重要作用[16]。本研究表明PhZEP基因在太子參生長過程的盛花期后10，40 d的表達量較高，與大黃塊根中ABA生物合成相關基因9-順式-環氧加氧酶基因、醛氧化醜基因和ABA 8'羥化酶基因的表達情況相似[17]，即在塊根生長過程的初期和中后期的表達上調。說明PhZEP基因可能對太子參塊根生長發育的初期和中后期發揮著重要的促進作用。此外，經外源ABA處理后太子參塊根中PhZEP的表達量與對照組相當，表明外源ABA可能不影響PhZEP的轉錄表達。生物合成抑制劑氟啶酮可通過抑制參與ABA合成的八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene desaturase，PDS）的活性來阻斷內源ABA的生物合成，但氟啶酮處理后PhZEP的表達量顯著高于對照組，類似結果在桑樹研究中也有出現[18]，表明PhZEP的表達可能還受其他因素的影響。

大米ZEP基因的突變，導致ABA的含量比較低[19]，在擬南芥處于鹽和干旱的逆境時，ZEP基因的過量表達，不僅增加了ABA含量，還上調了ABA與逆境響應相關的基因的表達水平[20]。此外，在植物的特定生長發育階段以及種子等非光合器官中，ZEP基因的表達水平同樣限制著ABA的合成[11，21]。本研究表明PhZEP基因在太子參不同組織中的轉錄表達以葉片最高，塊根最低，但在塊根生長發育過程中，PhZEP基因的高表達又主要在初期和中后期。因此，作者推測PhZEP基因的表達特性可能對太子參中ABA的生物合成起著關鍵性的作用。

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