當歸對陰虛哮喘Balb/c小鼠Th1/Th2及Th17/Treg的影響及機制研究

馬婷婷+馮興中+王學艷

[摘要] 當歸是臨床常用中藥，具有補陰養血、活血潤燥的功能。為研究當歸對陰虛哮喘Balb/c小鼠Th1/Th2及Th17/Treg的影響及機制，該實驗通過卵清白蛋白加甲狀腺素復制陰虛哮喘Balb/c小鼠模型，造模同時分別給予地塞米松（DXM）、當歸提取液、當歸提取液+DXM灌胃處理，HE染色進行肺組織病理學檢查，ELISA法檢測支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IL-4，IL-17，IFN-γ，TGF-β水平及維甲酸受體相關孤兒受體（RORγt）的表達情況。結果顯示，當歸可顯著減輕肺組織炎癥浸潤程度，升高IFN-γ/IL-4及TGF-β/IL-17的比值，降低肺組織中RORγt的表達強度，當歸與DXM配伍的治療效果最為顯著。提示，當歸可通過抑制肺組織RORγt表達、調節Th1/Th2及Th17/Treg的功能平衡，改善氣道的炎癥狀態，發揮對陰虛型哮喘的治療作用。

[關鍵詞] 當歸；陰虛哮喘；Balb/c小鼠；Th1/Th2；Th17/Treg

[Abstract] Angelicae Sinensis Radix， with nourishing Yin， promoting blood circulation， and moisturizing dryness functions， is commonly used in clinical medicine. In order to investigate the effects and mechanism of Angelica sinensis（AS） on Th1/Th2 and Th17/Treg in mice with asthma and Yin deficiency syndrome， asthmatic and Yin deficiency syndrome Balb/c mice models were established by injecting and inhaling ovalbumin（OVA） and thyroxin. The models were treated with dexamethasone（DXM）， AS extract and AS extract+DXM， respectively. Pathological examination of lung tissues was conducted by HE staining， and ELISA was used to detect the levels of IL-4， IL-17， IFN-γ， TGF-β as well as retinoic acid receptor-related orphan receptor （RORγt）. Results showed that AS could significantly improve the situation of inflammation infiltration， increase ratios of IFN-γ/IL-4 and TGF-β/IL-17， decrease the levels of RORγt in lung tissues. The AS+DXM group showed a best treatment effect. The results indicated that AS played a therapeutic role for asthma with Yin deficiency syndrome and improved airway inflammation by inhibiting the expression of RORγt in lung tissues and regulating the balance of Th1/Th2 and Th17/Treg.

[Key words] Angelicae Sinensis Radix； asthma with Yin deficiency syndrome； Balb/c mouse； Th1/Th2； Th17/Treg

哮喘（asthma）是我國臨床中常見的一種呼吸系統疾病，其臨床發作具有周期性、反復性、遷延不愈的特點[1-2]。2013年哮喘流行病學調查數據顯示，我國大陸地區哮喘總患病率高達1.24%，嚴重威脅公眾健康[3]。研究表明，哮喘發病的主要病理學機制是輔助性T細胞（Th）亞群的免疫功能失調，其中，Th1/Th2與Th17/調節性T細胞（Treg）的功能平衡是影響呼吸道炎性因子分泌及促炎癥反應的關鍵因素[4-5]。近年來，中藥以其多途徑、多靶點調節機體免疫功能的特點在臨床哮喘的治療中取得優勢。當歸（Angelica sinensis，AS）為補血養陰活血的常用中藥之一，《本草經疏》記載當歸有“主咳逆上氣”之功效[6]，以往實驗研究報道當歸揮發油對支氣管平滑肌有明顯的解痙作用[7]。然而，當歸對機體T細胞亞群的免疫調節機制目前尚未完全明確。本研究通過復制陰虛哮喘Balb/c小鼠模型，研究當歸對Th1/Th2及Th17/Treg細胞因子的影響，探討當歸治療哮喘的免疫調節機制，為當歸用于臨床哮喘的防治提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物與試劑 50只雌性Balb/c小鼠，周齡（7.2±0.8）周，體重（20.15±1.62） g，供應單位為北京中醫藥大學，合格證0014036，許可證號SCXK（京）2016-0024。當歸提取液由上海和黃藥業有限公司生產（國藥準字Z31020419）。致敏試劑卵清白蛋白（OVA）購自美國Grade V Sigma公司（批號101069301）。甲狀腺片購自山東中泰藥業有限公司（國藥準字H37021712，批號14080303），地塞米松磷酸鈉注射液（DXM）由河南科倫藥業有限公司提供（國藥準字H41023598，批號13011911），ELISA細胞因子試劑盒購自R&D systems（美國），免疫組化試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司（批號AD082522）。

1.2 動物模型制備 50只Balb/c小鼠根據隨機數字表法平均分為5組，每組10只，分別為空白對照組、陰虛哮喘組、地塞米松組、當歸組及當歸+地塞米松組。實驗開始時，使用溶質為OVA 1 mg和氫氧化鋁凝膠100 mg的生理鹽水混懸液制備哮喘致敏液，除對照組外，所有小鼠均給予2次致敏液1 mL腹腔注射行全身致敏處理，注射時間間隔為1周（1 d，8 d）。全身致敏1周后（15 d）起，所有小鼠霧化吸入1%OVA行呼吸道致敏，隔日致敏1次，對照組不進行致敏處理，采用生理鹽水代替致敏藥物行腹腔注射及霧化吸入。給予DXM組、當歸組及當歸+DXM組小鼠DXM（0.5 mg·kg-1）、當歸提取液（4 g·kg-1）、當歸提取液+DXM（4 g·kg-1+0.5 mg·kg-1）灌胃處理，對照組及陰虛哮喘組以20 mL·kg-1生理鹽水灌胃處理，霧化激發及藥液灌胃均連續28 d。實驗第29天開始，各組小鼠藥液灌胃后8 h給予甲狀腺素120 mg·kg-1（采用0.5%黃原膠助懸）灌胃處理制備陰虛模型，1次/d，連續14 d，對照組給予0.5%黃原膠對照液灌胃處理[8-9]。

1.3 支氣管肺泡灌洗液（BALF）的收集 實驗第43天，將小鼠麻醉處理后氣管插管，結扎左支氣管，使用生理鹽水反復灌洗右側支氣管肺泡并記錄每次灌洗液回收量，3次灌洗液回收率均大于80%，提取各組BALF約2.5 mL/鼠離心處理（2 000 r·min-1，10 min），將上清液儲存備用，儲存溫度為-80 ℃。

1.4 細胞因子檢測 所有BALF上清液收集完畢后，于4 ℃條件下解凍，根據ELISA試劑盒說明書的操作方法，分別檢測各組Balb/c小鼠致敏前后及藥劑處理前后細胞因子IL-4，IL-17，IFN-γ，TGF-β水平。取所有灌洗液沉淀涂片，瑞士染色后采用血細胞計數板進行炎性細胞、中性粒細胞及嗜酸性粒細胞分類計數。

1.5 肺組織病理學改變及免疫組化檢測 將未經灌洗的左肺組織制作石蠟切片，根據免疫組化試劑盒說明進行染色后，在高倍鏡下觀察肺組織病理學改變及維甲酸受體相關孤兒受體（RORγt）的表達情況，對肺組織炎性細胞浸潤程度進行半定量檢測。

1.6 統計學分析 將整理后的所有檢測數據錄入SPSS 19.0軟件，計數資料采用±s表示，組間數據檢驗采用單因素方差分析，等級資料比較采用Ridit分析，P<0.05時差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠BALF沉淀中炎性細胞計數的比較 采用甲狀腺素及OVA致敏后，陰虛哮喘組小鼠BALF沉淀中炎性細胞、中性粒細胞及嗜酸性粒細胞較對照組均顯著升高（P<0.01），經當歸及DXM治療后，炎癥浸潤情況明顯減弱（P<0.05，P<0.01），其中，當歸+DXM組小鼠嗜酸粒細胞水平低于當歸組及DXM組（P<0.05），見表1。

2.2 各組小鼠肺組織病理學改變的比較 鏡下觀察發現，對照組小鼠肺組織病理變化不明顯，模型組小鼠肺組織出現明顯的病理變化：氣道上皮細胞腫脹、部分脫落，基底膜較厚，支氣管壁充血、結構模糊。經DXM和當歸干預后，上述肺組織病理學變化得到不同程度的緩解。對肺組織炎性細胞浸潤情況進行半定量分析結果顯示，當歸+DXM組與陰虛哮喘組比較，差異有統計學意義（P<0.01），見圖1，表2。

2.3 各組小鼠BALF中細胞因子水平的比較 對各組小鼠BALF中促炎因子IL-4，IL-17及炎癥抑制因子IFN-γ，TGF-β的水平進行檢測，數據顯示，采用OVA及甲狀腺素致敏處理后，小鼠BALF中促炎因子水平均顯著高于對照組且炎癥抑制因子水平明顯下降（P<0.01，P<0.05）。經當歸及DXM處理后，3組藥劑組小鼠BALF中促炎因子水平降低且炎癥抑制因子明顯回升（P<0.05，P<0.01）。其中，當歸+DXM組細胞因子水平明顯優于DXM組（P<0.05），見表3。

2.4 各組小鼠BALF中IFN-γ/IL-4，TGF-β/IL-17的比較 經OVA及甲狀腺素致敏處理后，陰虛哮喘組小鼠IFN-γ/IL-4與TGF-β/IL-17的比值較對照組

出現顯著降低（P<0.01），表明此時小鼠存在明顯的Th1/Th2及Th17/Treg功能失衡。3組藥劑組小鼠BALF中兩者的比值較陰虛哮喘組均有回升（P<0.05，P<0.01），其中，當歸+DXM組小鼠的比值為全組最高水平（P<0.05），見表4。

2.5 各組小鼠肺組織中RORγt表達的比較 檢測小鼠肺組織中RORγt的表達，發現陰虛哮喘組小鼠肺組織中RORγt的表達強度最高（P<0.01），經不同藥劑處理后，RORγt的表達較陰虛哮喘組均出現明顯減弱（P<0.01），其中，當歸+DXM組RORγt的表達明顯低于DXM組（P<0.05），見表5。

3 討論

哮喘又稱為支氣管哮喘，是一種以氣道慢性炎癥、黏液高分泌及氣道重塑為主要病理生理特征的慢性呼吸系統疾病[10-11]。近年來，我國哮喘的發病率呈持續上升趨勢[12]，發病時，患者由于嗜酸性粒細胞及多種炎性細胞浸潤氣道引起的過敏反應及氣道高反應性而出現一系列喘息、胸悶等可逆性呼吸氣流限制癥狀，嚴重者可導致急性呼吸衰竭，嚴重影響患者的生活質量及身體健康[13]。

Th1/Th2功能失調是目前被普遍認同的哮喘發病的核心免疫機制[14]，Th2型免疫反應增強而Th1型免疫反應減弱，IL-4的高表達降低了炎癥抑制因子IFN-γ的活性，使患者血IgE濃度增加及氣道嗜酸性粒細胞聚集，導致支氣管平滑肌痙攣及氣道通氣功能下降[15-16]。近期研究中發現[17]，除Th1與Th2之外，Th17與Treg在正常機體中相互制約而處于平衡狀態，當機體受到致敏原刺激處于超敏反應狀態時，Th17與Treg的功能平衡被打破，Th17的特征性細胞因子IL-17分泌增多，導致大量炎性細胞尤其是中性粒細胞趨化聚集于氣道，進一步促進并加重氣道的促炎癥反應 [18-19]。Treg細胞通過分泌TNF-β抑制嗜酸性粒細胞的活化，減少Th2細胞促炎癥因子的分泌從而緩解氣道炎癥，抑制哮喘反應的發生[17，20]。

當歸是臨床常用的中藥，具有補陰養血、活血潤燥的功能，臨床廣泛應用于包括呼吸系統在內的各種疾病。祖國醫學認為，當歸味甘而重，故專能補血養陰，其氣輕而辛，故又能行血，補中有動，行中有補，為陰分血中之要藥?，F代藥理研究證實，當歸對痙攣的支氣管平滑肌具有明顯的解痙作用[7]。

本實驗采用OVA與甲狀腺素復制陰虛哮喘小鼠模型，致敏后，陰虛哮喘組小鼠BALF中IFN-γ/IL-4及TGF-β/IL-17的比值顯著降低，出現明顯的Th1/Th2及Th17/Treg功能失調。當歸治療后，BALF中IFN-γ/IL-4及TGF-β/IL-17的比值較陰虛哮喘組明顯回升，其中，當歸+DXM小鼠BALF中細胞因子表達水平明顯優于DXM組及當歸組，提示當歸與DXM配伍可表現出良好的協同作用，通過改變Th1/Th2及Th17/Treg的功能平衡，提高激素對陰虛哮喘的療效，實現平喘作用。

哮喘的發病與演變是多種炎性細胞共同參與的結果，以往研究報道，嗜酸性粒細胞浸潤引起的氣道過敏反應造成氣道的高反應狀態，而氣道內中性粒細胞集聚增多可作為哮喘急性加重的標志[21-22]。本實驗結果顯示，當歸組小鼠BALF中炎性細胞、中性粒細胞及嗜酸性粒細胞較陰虛哮喘組明顯降低，當歸+DXM小鼠BALF中嗜酸性粒細胞明顯低于DXM組，表明當歸有助于緩解氣道炎性細胞的浸潤，改善氣道炎癥及超敏狀態。

轉錄因子RORγt在哮喘的免疫致敏過程中可促進Th17的分化與激活并發揮與IL-17的協同作用[17，23]。本實驗對小鼠肺組織中RORγ進行檢測發現，陰虛哮喘小鼠肺組織中RORγt的表達明顯增強，當歸處理后肺組織中RORγt的表達強度明顯降低，當歸+DXM組小鼠RORγt的表達明顯低于DXM組，提示當歸可通過抑制肺組織中RORγt的高表達，降低Th17細胞活性，平衡Th17/Treg功能，成為當歸改善氣道炎癥反應的機制之一。

綜上，當歸可通過抑制肺組織RORγt的高表達、調節Th1/Th2及Th17/Treg的免疫功能平衡，緩解氣道的炎癥狀態，提高氣道通氣功能并最終改善哮喘，為臨床哮喘的輔助用藥方案提供了新思路。

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