大鼠急性肝損傷（肝郁脾虛證）病證結合模型的研究

黃娜娜 孫曉倩 楊倩 李曉宇

[摘要]建立適宜于抗急性肝損傷（肝郁脾虛證）中藥復方活性發現、藥效評價和新藥研發的方證相應動物模型。依照中醫病因病機演變規律和現代病理機制研究，抽提適宜于急性肝損傷（肝郁脾虛證）大鼠動物模型評價的證候、確定積分，根據藥證相符原則選定逍遙丸和水飛薊賓葡甲胺片為模型反證藥物，大鼠每天腹腔注射豬血清，并按分組給予不同配比高脂低蛋白飼料及食用乙醇進行誘導；共7 d。實驗期間每日觀察大鼠的體重、食量、飲水量及一般觀察并對其進行中醫證候積分，實驗結束檢測大鼠血清ALT，AST，PA，TBIL，TBA等肝功能指標的水平，檢查肝組織病理學變化。在造模1周后，各模型組的大鼠均達到明顯急性肝損傷程度，且大鼠主證、次證均符合肝郁脾虛證的證候表現。與正常對照組比較，血清ALT和AST活性升高，TBIL和TBA含量升高，PA含量降低；肝組織病理形態學檢查顯示各模型組的大鼠均出現炎細胞浸潤、嗜酸性變或嗜酸性脂肪變，反證藥物組可不同程度改善上述病變表現。腹腔注射豬血清+高脂低蛋白飼料（895%玉米粉、10%豬油、05%膽固醇）+10%食用乙醇連續造模7 d，經藥物反證，可建立擬臨床肝郁脾虛證的急性肝損傷大鼠模型，具有成模耗時短、死亡率低、動物狀態與臨床患者證候表現相近等特點，可適用于抗急性肝損傷（肝郁脾虛證）中藥復方活性發現、藥效評價、新藥研發和臨床方證相關性研究與機制探討。

[關鍵詞]急性肝損傷； 肝郁脾虛證； 病證結合； 大鼠； 動物模型

Research on rat models of acute liver injury with syndrome of

liver depression and spleen deficiency

HUANG Nana1，2， SUN Xiaoqian2， YANG Qian3， LI Xiaoyu1， SUN Rong1*

（1 Shandong Academy of Chinese Medicine， Ji′nan 250014， China；

2 Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Ji′nan 250355， China；

3 Rizhao City Hospital of Traditional Chinese Medicine， Rizhao 276800， China）

[Abstract]This paper aimed to establish animal models which are suitable for the activity found， efficacy evaluation of herbs resistant to acute liver injury with syndrome of liver depression and spleen deficiency and new drug research and development based on corresponding of formula and syndrome The symptoms that are suitable for evaluating the rat models of acute liver injury with syndrome of liver depression and spleen deficiency were extracted according to the evolution rule of the etiology and pathogenesis in traditional Chinese medicine and the modern pathological mechanism Xiaoyao pill and silibin meglumine tablets were used as drug counter evidence for models in accordence with the principle of consistence of prescription and syndrome Rats model were fed with highlipid and lowprotein fodder of different proportion and induced by intraperitoneal injection with pig serum， intragastric administration with edible alcohol once a day for 7 days Daily record of body weight， daily food intake and daily water intake were conducted day after day in experimental session Symptoms were also observed and evaluated by score at the same time The contents of ALT， AST， PA， TBIL and TBA in serum were detected and histopathological changes of liver were checked at the ending of experiment Obvious acute liver injury occurred to all rats in model groups at 1 week following model induction Both main symptoms and secondary symptoms were consistent with syndrome manifestation of liver depression and spleen deficiency Compared with normal control group， the activity of ALT，AST and contents of TBIL，TBA in serum increased and the content of PA decreased Liver tissue pathological morphology showed inflammatory cells infiltration， eosinophilic or eosinophilic adipose change in hepatocytes of rats in model groups All the above lesions manifestation could be improved by drug counterevidence By the disproof of medicine， rat models of acute liver injury with syndrome of liver depression and spleen deficiency could be induced by fed with highlipid and lowprotein fodder which contained 895% cornstarch， 10% lard and 05% cholesterol， intraperitoneal injected with pig serum， intragastric administrated with edible alcohol for 7 days The rat models with a low mortality could be induced in a short time and animal status were similar to syndrome performance of patients So the rats models are suitable for the activity found， efficacy evaluation and drug discovery of herbs resistant to acute liver injury with syndrome of liver depression and spleen deficiency， and also can be used in the research of correlation between prescription and syndrome and its mechanism

[Key words]acute liver injury； liver depression and spleen deficiency； combination of disease and syndrome； rat； animal model

doi：10.4268/cjcmm20162318

急性肝損傷主要是由病毒感染、藥物服用不當、過量飲酒、高脂飲食因素造成的急性肝功能異常為代表的疾病。中醫并無此病名，因黃疸貫穿于該病始終、且臨床表現多勢急病重，并多伴有神志昏蒙等證候，故中醫多將其歸為“急黃”范疇，多由飲食不節、飲酒、情志不遂等因素造成。隨著現代生活方式的改變，魯曉嵐等[12]依據人群流行病學調查結果分析發現，長期飲酒并且飲食中碳水化合物、纖維素食物攝入較少，容易引起肝損傷。近年來研究證實[35]乙醇及飲食不當等因素已成為該病證主要誘因，中醫藥治療急性肝損傷（肝郁脾虛證）療效顯著，引起國內外學者關注。

如何科學研究急性肝損傷（肝郁脾虛證）的現代中醫病理機制、病程轉歸、療效評價，如何快速、準確發現治療急性肝損傷（肝郁脾虛證）的中藥創新藥物，都亟待構建一個適宜于急性肝損傷（肝郁脾虛證）現代中醫藥研究的病癥結合模型。目前該領域研究主要應用西藥藥理學的四氯化碳、D氨基半乳糖、α柰基異硫氰酸酯、醋氨酚、異煙肼、四環素、刀豆球蛋白A、乙醇等單因素導致大、小鼠的急性肝損傷模型，或卡介苗+脂多糖、乙醇+高脂飼料、豬血清+四氯化碳+乙醇等多因素導致的急性肝損傷模型[6]，并無急性肝損傷（肝郁脾虛證）結合模型應用。

本研究在西醫辨病、中醫辨證、以病統證的基礎上，借鑒了“從癥辨證”的中醫辨證思維，利用乙醇，高脂飼料及豬血清注射三者結合的復合誘發因素，模擬臨床發病過程中“乙醇刺激”、“飲食不當”、“免疫損傷”等造成的體內多維度、多層級的病理損傷過程，同時根據中醫對本病證的認知規律，遵循“正虛不能抗御外邪從而導致濕熱毒邪入侵，由氣入血，進而肝阻脾胃，臟腑功能失調，最后血脈受病，肝絡瘀阻”的病機過程，通過對“乙醇刺激”、“飲食不當”、“免疫損傷”造模條件的優選，制備急性肝損傷（肝郁脾虛證）大鼠動物模型，以期得到一種適宜于中藥復方活性發現、藥效評價、新藥研發和臨床方證相關性研究的急性肝損傷（肝郁脾虛證）動物模型。

1材料

SPF級雄性Wistar大鼠100只，體重180～220 g，健康、適齡，購自山東大學實驗動物中心，動物合格證號SYXK（魯）20140001。實驗動物配合飼料（鼠），生產許可證號SCXK（魯）20140014。

水飛薊賓葡甲胺片購自湖南千金協力藥業有限公司（批號20140201），配制為質量濃度0010 8 kg·L-1的溶液。

逍遙丸購自河南省宛西制藥股份有限公司（批號140109），配制為質量濃度1296 0 kg·L-1的溶液。

食用乙醇為市售紅星二鍋頭，本實驗用20%，10%乙醇由食用乙醇與蒸餾水稀釋而成；膽固醇購自上海源聚生物科技有限公司；豬油為市售；豬血清購自上海憶欣生物科技有限公司，批號20141214。

丙氨酸氨基轉移酶（ALT），天冬氨酸氨基轉移酶（AST），前白蛋白（PA），總膽紅素（TBIL），總膽汁酸（TBA）等檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所，批號分別為20140329，20140328，20140605，20140329，20140401。

PL303精密電子天平（瑞士梅特勒托利多儀器有限公司）；可調式移液器（上海賽默飛世爾儀器有限公司）；Multiskan Go1510全波長酶標儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；TDZ5WS臺式低速離心機[湘儀（湖南）離心機儀器有限公司]；DZKMS6電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫療儀器廠）；UV2600型紫外分光光度儀（中美合資尤尼柯有限公司）。

2方法

21適宜于動物模型評價的急性肝損傷（肝郁脾虛證）診療指標抽提目前公認的急性肝損傷診斷標準主要為乏力、食欲減退、惡心，體征表現為肝腫大并有壓痛、肝區叩擊痛，部分患者可有輕度脾腫大，血生化檢查為ALT及AST活性升高[7]。公認的肝郁脾虛證診斷標準主要分為2部分[78]，主證：脅肋脹痛，食后腹脹或腹脹午后加重，倦怠乏力，食欲不振，大便稀溏或時溏時干；次證：惡心噯氣，煩躁易怒，時時太息，神疲懶言，舌質淡，脈弦或弦緩脅肋作痛、腹脹食少、情緒抑郁、便溏不爽，或腹痛欲便、瀉后痛減、脈弦緩。而目前尚無公認的中醫急性肝損傷（肝郁脾虛證）診斷標準。

本研究基于上述標準選擇 ①癥狀和體征指標：主癥，飲食、飲水減少，舌淡、腹脹、便溏；次癥，精神不振，眼睛、耳廓和爪趾顏色變淡，毛色發黃，尾部有瘀斑，體重下降。擬建立大鼠證候積分評價量表（表1）。②肝臟病理組織學檢查可見炎細胞浸潤。③血清ALT，AST，TBA，TBIL水平升高，PA水平降低。④藥物反證療效顯著。

22造模刺激條件的優化設計依據既往文獻報道[6，910]不同乙醇濃度（10%～60%）灌胃不同天數可導致大鼠急性肝損傷模型，也有報道連續60 d用高脂低蛋白飲食喂養大鼠，會對正常大鼠肝臟造成明顯的損害[11]。中醫認為乙醇+飲食不當所致急性肝損傷為氣、血、痰、濕相互搏結，其發病規律多為正虛不能抗御外邪從而導致濕熱毒邪入侵，由氣入血，進而肝阻脾胃，臟腑功能失調，最后血脈受病，肝絡瘀阻。依據臨床證候抽提分析，本研究以大鼠一般狀況、血清ALT和AST水平、死亡情況等指標對復合因素中的高脂低蛋白飼料及乙醇配比（表2）進行優化比較研究。

23動物分組及給藥雄性Wistar大鼠隨機分成正常對照組、造模2和4組（見優化結果）、及其各自的水飛薊賓葡甲胺片和逍遙丸藥物反證組。2和4造模組及各自的藥物反證組均按10 mL·kg-1體重給藥，藥物反證組分別給予0108 g·kg-1的水飛薊賓葡甲胺片溶液和12960 g·kg-1的逍遙丸溶液，每日灌胃1次，共7 d；正常對照組飼以正常飼料和普通飲用水。

24觀察指標與檢測方法分別在第0，1，3，5，7天觀察記錄大鼠一般狀況、癥狀體征情況及證候積分、體重、食水量、死亡情況。第8天大鼠眼眶靜脈叢取血，3 500 r·min-1離心10 min，取血清，并按照相關試劑盒說明書的操作說明，用自動生化分析儀測定血清中ALT，AST，PA，TBIL，TBA等指標水平。取血后解剖去腦、肝、脾、胸腺組織并稱重，計算臟器指數，一部分肝組織進行常規HE染色，光學顯微鏡下觀察其組織形態學變化；另一部分肝組織-80 ℃保存。

25統計學方法采用SPSS 115統計軟件，數據用±s表示，計量資料先進行正態檢驗，正態分布資料采用單因素方差分析，非正態分布資料先轉換成正態分布再用單因素方差分析。進行組間比較，P<005為數據統計有顯著性差異。

3結果

31造模條件確認實驗結果表明，除模型4組，其余3組大鼠均出現死亡，死亡率模型1組最高，ALT及AST值模型1組最大，模型4組最小，優化結果表現為模型4組大鼠最好，其次為模型2組，再次為模型3組，最差是模型1組（表3）。因此，為符合臨床該病特點，本實驗選擇既有臨床證候診斷指標，又有臨床表現程度的2和4組作為模型組。

32造模對大鼠日食量及日水量的影響實驗結果表明，模型2組與4組在給藥后日食量與日水量均下降。與正常對照組比較，各模型組日食量在第7天差異顯著（P<005）（表4）；日水量在第3天均出現了顯著性差異（P<001），第7天復合因素模型組差異性極顯著（P<0001）（表5）；食水量指標變化及藥物反證結果提示，造模7 d動物出現急性肝損傷（肝郁脾虛證）的證候表現。

33造模對大鼠擬臨床證候積分的影響實驗期間，正常組大鼠一般活動正常，毛色光亮、眼睛有神，未見糞尿的異常改變。2個模型組呈現不同程度的大鼠行為倦怠、欠活潑，舌淡，腹部腫脹，耳廓和爪趾顏色變淡，毛色發黃，尾部少許瘀斑等；部分大鼠出現便溏現象，模型2組大鼠疾病情況最為嚴重，且出現死亡情況（圖1）。模型2組、4組與正常組進行比較，其中醫證候積分在第3天均出現顯著性差異（P<005或P<001），到第7天復合因素模型組差異性極顯著（P<0001）（表6）。證候積分變化及藥物反證結果提示，造模7 d動物出現急性肝損傷（肝郁脾虛證）的證候表現。

34造模對大鼠體重的影響實驗期間，正常對照組大鼠健康狀況良好，靈活好動、反應敏捷、毛發光澤、飲食糞便正常、體重持續增加，無死亡；模型2組大鼠健康狀況一般，較為慵懶，飲食糞便正常，體重持續增加，實驗結束時死亡2只，第7天，與正常對照組比較，體重差異性極顯著（P<0001）；模型4組大鼠健康狀況一般，較為慵懶，飲食糞便正常，體重持續增加，無死亡，與正常對照組比較，無顯著性差異（表7）。大鼠體重變化及藥物反證結果提示，造模7 d動物出現急性肝損傷（肝郁脾虛證）的證候表現。

35造模對大鼠臟器系數的影響與正常對照組比較，其他各組的臟器系數均有不同程度的升高；模型2組大鼠出現肝臟腫大，肝系數升高，胸腺系數及脾系數升高，均呈現極顯著的差異性（P<0001），模型4組也出現肝臟腫大，肝系數升高，胸腺系數及脾系數升高，具有顯著性差異（P<001）（表8）。

36造模對大鼠血相關指標的影響正常組大鼠各血肝功指標水平均在正常范圍內。與正常組比較，各模型組及陽性藥組在給藥后7 d血清ALT，AST，TBA，TBIL水平升高，PA水平降低；與模型2組比較，模型4組血清中ALT，TBIL水平偏低，具有顯著性差異（P<005），AST水平偏低，具有顯著性差異（P<005或P<001），而TBA和PA無顯著性差異（表9）。

37造模對大鼠肝組織形態的影響造模對大鼠的肝臟組織Riddit分析病理分級結果顯示，正常組肝小葉結構清晰完好，肝細胞未見明顯變性、壞死，肝竇未見明顯淤血擴張；模型2組部分肝細胞嗜酸性脂肪變，部分壞死，匯管區及間質慢性炎細胞浸潤（P<0001），模型4組部分肝細胞嗜酸性變，匯管區慢性炎細胞浸潤（P<001）（表10）。對用復合因素造模7 d后大鼠的肝組織病理改變進行觀察（圖2）。

4討論

急性肝損傷最早由《內經》描述，如《素問·六元正氣大論篇》載：“濕熱相搏，民病黃癉”，且《諸病源候論》的以下原文可證，“脾胃有熱，谷氣郁蒸，因為熱毒所加，故猝然發黃”，“發汗不解，溫毒氣郁結在胃，小便為之不利，故變成黃，身如橘色”，“嶺南中瘴氣，土人連歷不瘥，變成此病不須治也”，“黃病者，是熱人脾胃，熱氣蘊積，與谷氣相搏，蒸發于外，故皮膚系黃?！?此或是傷寒，或時行，或瘟病，皆由熱不時解，所以入胃也”。對上述認識歸納總結后主要表現為：毒邪是致病的基本因素，正虛是發病和邪氣滯留的關鍵，血瘀是病證的主要特點[12]。本實驗的造模方法中，致病因素乙醇屬中醫“濕毒”范疇，酒毒內侵、肝膽濕熱；高脂屬“血瘀”范疇，脾胃失調，肝膽不利；豬血清刺激屬“本虛”范疇，素體正虛且感受濕邪，濕阻中焦，進而導致肝氣郁滯，形成急性肝損傷（肝郁脾虛證）。

本研究在對急性肝損傷及肝郁脾虛證臨床證候表現統計分析基礎上制訂中醫證候積分評價量表，通過觀察大鼠死亡情況、血清生化指標、肝組織病理情況，同時采用治療肝郁脾虛證的經典名方逍遙丸及治療急性肝損傷的常用藥物水飛薊賓葡甲胺片，經過中藥及西藥反證急性肝損傷（肝郁脾虛證）病證結合動物模型，觀察藥物改善指標變化的靈敏度，以確定模型建立成功與否。

結果顯示，本研究建立的急性肝損傷（肝郁脾虛證）病證結合動物模型，體征變化情況與擬定診斷標準基本一致，肝臟病理學改變主要體現在肝細胞嗜酸性變，匯管區慢性炎細胞浸潤，血中指標ALT，AST，TBA，TBIL水平升高和PA水平降低；模型2組死亡率達20%，藥物反證組無死亡，而模型4組無死亡，藥物反證組亦無死亡，可能與常規高脂低蛋白飼料中豬油含量過高有關，加之豬血清及乙醇的共同刺激，導致造模過度，引起大鼠死亡。與模型組比較，各藥物反證組大鼠ALT，AST，TBA，TBIL水平降低，PA水平升高，肝組織中炎癥反應減少，嗜酸性變降低，有統計學意義；比較兩藥物反證組的血相關指標值及病理變化程度，可發現逍遙丸組對模型的改善程度優于水飛薊賓葡甲胺片組。通過上述分析結果，可發現優化后的模型4組成活率高、耗時短，且與臨床上急性肝損傷（肝郁脾虛證）患者的發病原因，證候特點較為貼切，適用于該類藥物的后期研究。

綜上所述，本實驗在考察高脂及乙醇2個因素對模型影響的基礎上，通過優化高脂飼料配比，建立了一個成活率高、耗時短，且與臨床急性肝損傷（肝郁脾虛證）典型證候變化相適應的大鼠模型，為后期應用于中藥復方活性發現、藥效評價、新藥研發和臨床方證相關性研究奠定基礎。

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[責任編輯馬超一]