堆肥過程不同分子量水溶性有機物電子轉移能力的演變及影響因素

楊超 何小松 高如泰 席北斗 黃彩紅 張慧 檀文炳 李丹

摘要利用超濾技術、電化學方法和光譜技術，以堆肥水溶性有機物的不同分子量（MW）組分為研究對象，分析在堆肥過程中不同分子量水溶性有機物（DOM）的組成特征、結構演變和電子轉移能力變化的影響因素。結果表明，類蛋白物質主要存在于堆肥前期的DOM（MW<1kDa）中，隨著堆肥的進行，類蛋白物質不斷降解，類富里酸物質持續合成，堆肥后期類蛋白物質被完全降解，類富里酸物質成為DOM（MW<1kDa）主要的熒光組分。類腐殖物質是DOM（MW=1～3kDa）、DOM（MW=3～5kDa）和DOM（MW>5kDa）的主要熒光組分，堆肥過程中類腐殖質物質在3種不同分子量組分的變化各不相同，但是堆肥后期類腐殖質物質在3個不同分子量組分的含量均高于堆肥初期。堆肥過程中DOM（MW<1kDa）的電子供給能力（EDC）呈降低趨勢，而電子接受能力（EAC）呈升高趨勢；DOM（MW>5kDa）的EDC在堆肥過程中呈上升趨勢，而EAC則無明顯的變化規律。DOM（MW=1～3kDa）和DOM（MW=3～5kDa）的EDC和EAC在整個堆肥過程無明顯變化規律。不同分子量組分堆肥DOM的EAC受控于堆肥過程木質素降解產物的含量，而其EDC變化與熒光參數和紫外參數無明顯關系。

關鍵詞堆肥；水溶性有機物；分子量；電子轉移能力；平行因子分析

1引言

隨著我國經濟的發展，飲食結構發生很大改變，每年對肉類、牛奶等消費量以接近10%的速度增長[1]。人們對畜牧產品的消費需求導致畜牧養殖業成為我國農業經濟的重要部分，與此同時，養殖廢棄物不合理的處理已成為我國農業面源污染的主要來源之一[2]。堆肥由于其低成本和無污染等優點，成為我國處理畜禽糞便的重要處理方式[3，4]。堆肥是生物強化處理工藝，在該過程中有機物被降解成二氧化碳或者轉化成腐殖酸[5]。水溶性有機物（Dissolvedorganicmatter，DOM）是堆肥過程有機物轉化最活躍的部分，其中脂肪類，多糖類和蛋白類化合物優先被微生物降解，而芳香族物質則穩定存在，且在此過程中不斷積累[6，7]。

DOM的組成復雜，既包括小分子的有機酸、糖類等，又包括大分子的蛋白質和腐殖質[8，9]。在自然生態系統中，DOM可作為營養物質參與微生物的生命活動，同時其吸附和還原能力影響污染物在環境中的遷移和轉化[10，11]。DOM通過氧化還原能力介導地球化學反應的能力，使其能夠強化微生物和污染物之間的電子傳遞，進而影響污染物的存在形態，因此電子轉移能力是衡量DOM環境效應的重要指標。腐熟的堆肥產品含有較低的易降解的有機物和較高含量的有機大分子物質[3，5，6]，施加于土壤后可改善土壤的理化性質，加速污染物的轉化。因此研究堆肥過程中DOM結構和組成的演變，以及其對DOM的電子轉移能力影響，能夠拓寬堆肥產品的應用途徑。

不同分子量DOM在光化學反應和生物反應具有重要作用[12]。已有研究表明，低分子量的DOM（MW<1kDa）容易被微生物利用，而高分子量DOM（MW>15kDa）具有較強的穩定性[13]。不同分子量DOM的結構、穩定性、腐殖化程度和芳香性不同[14，15]，RomeraCastillo等采用色譜分析法發現，DOM的分子量可能影響DOM的結構和熒光性能[16]。文獻＼[17，18＼]表明，堆肥前期DOM主要為分子量小于1kDa組分，而堆肥后期DOM主要為分子量大于25kDa的組份，且堆肥過程中小分子量的物質可能被轉化成大分子量物質。不同分子量的DOM組成和結構不同，其電子轉移能力不同，但是DOM分子量和電子轉移能力的關系卻鮮有報道。

本研究采集雞糞堆肥過程中5個典型樣品，并提取DOM。采用超濾的方法將DOM分成4種不同分子量組分，即MW<1kDa、MW=1～3kDa、MW=3～5kDa和MW>5kDa。通過電化學的方法對堆肥DOM不同分子量組分的電子轉移能力進行測定，并采用紫外可見光譜和熒光光譜對其組成和結構進行了表征，以期揭示堆肥過程不同分子量DOM的組成差異、結構演變特征、電子能力變化及影響因素。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

AnalytikJenaMultiN/C2100型TOC分析儀（德國耶拿公司）；UNICO2600A紫外分光光度計（美國優尤尼柯公司）；HitachiF7000型熒光光譜儀（日本日立公司）；3種不同截留分子量（1、3和5kDa）的超濾膜（科氏（KOCH）公司）；CHI660e型電化學工作站（上海辰華有限公司）。1，1′乙撐2，2′聯吡啶二溴鹽（DQ，中國計量科學研究院）；2，2聯氮二（3乙基苯并噻唑6磺酸）二銨鹽（ABTS，上海君川科技有限公司）。實驗所用電極均購于上海辰華有限公司。實驗用水均為MilliQ超純水（美國Millipore公司）。

2.2堆肥樣品的采集和堆肥過程

在北京市昌平區某養雞場采集新鮮雞糞，輔以鋸屑和干草，調節堆肥物料中雞糞、鋸屑和干草的配比為6：2：1、C/N（碳氮比）約為26、含水率為50%～60%（質量比）后[19]，實驗室內于高400mm、寬330mm的圓桶式靜態堆肥設備中進行堆肥。前3d堆體溫度由25℃迅速上升到50℃，第4d達到最高溫度63℃。堆肥進行到第7d后溫度逐漸下降，到第16d堆體溫度穩定在室外溫度。此時對堆肥物料翻堆，并再次將含水率調到50%～60%范圍內使其進行二次發酵。于堆肥1，8，16，28和40d從上到下采集不同高度的3份樣品，并充分混勻，依次編號為S1，S2，S3，S4和S5，隨后在

55℃冷凍干燥，充分研磨后過100目篩。

2.3樣品的提取和制備

將研磨篩分后的樣品與超純水按固液比（w/V）1〖KG-3∶〖KG-510進行DOM的提取，室溫200r/min水平振蕩24h，于4℃以10000r/min離心10min，上清液過0.45μm醋酸纖維濾膜，得到DOM。

參考已有的分子量分組方法[20，21]，通過3種不同截留孔徑的超濾膜將DOM分為<1kDa，1～3kDa，3～5kDa和>5kDa的4個組分。采用TOC分析儀測定樣品的溶解性有機碳，以DOC表示。

2.4電子轉移能力的測定

參考文獻＼[22＼]介導電化學氧化（Mediatedelectrochemicalreduction，MER）和介導電化學還原（Mediatedelectrochemicaloxidation，MEO）的方法并略作改動。將電化學測得電子轉移能力（Electrontransfercapacity，ETC）與采用傳統微生物還原方法測得電子轉移能力[8，23]進行相關性分析，發現二者呈顯著正相關（數據未給出）。具體方法如下：以直徑3mm的玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極作為對電極。ABTS和DQ分別作為介導電化學的氧化劑和還原劑，0.61V作為介導電化學氧化電勢，

0.49V作為介導電化學還原電勢。反應之前，2.5mL0.2mol/LKCl，2.5mL0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7）作為反應溶液，通氮氣5min去除反應液的氧氣。隨后加入1mLDQ（0.1g溶于50mL水）或ABTS（0.2g溶于50mL水），反應平穩后，加入待測樣品（溶液的最終碳濃度為30mg/L），反應進行兩次。同時整個反應均在無氧環境中進行。ETC的計算公式為：

〖JZ（ETC（EDC或EAC）=Ap/（e·NA·MC）〖JZ）（1）

其中ETC的單位為μmole（gC）

，AP是曲線總積分庫倫，e表示電子所帶電荷，NA是阿伏伽德羅常數。MC是反應體系中的碳含量（0.21mg）。

2.5光譜分析

光譜測量之前，所有樣品的DOM均調為10mg/L。熒光光譜掃描狹縫為5nm，掃描速度為1200nm/min，PMT電壓為700V，發射波長（Em）掃描范圍為280～500nm，激發波長（Ex）的掃描范圍為200～450nm。以超純水作為空白，DOM熒光圖譜減去空白熒光圖譜后進行平行因子分析。

將堆肥5個階段不同分子量DOM樣品轉化為三維的數據矩陣（20個樣品×50×55Em），在MATLAB7.0（Mathworks，Natick，MA）上的DOMFluortoolbox（www.models.life.ku.dk）使用平行因子對三維數據矩陣進行解析。得分值用Fmax值表示，同時以其在樣品的百分比研究組分的演變[6]。

同樣將樣品DOC調為10mg/L，紫外光譜的掃描間距為1nm，掃描范圍為190～700nm。采用E270表示270nm處的吸光度，計算270nm處的特征吸收參數SUVA270（SUVA270=E270/DOC）[24]。

使用SPSS16.0進行數據統計分析。使用Origin9.0進行圖形繪制。

3結果與討論

3.1堆肥DOM不同分子量熒光組分

平行因子法是對三維熒光光譜數據進行熒光物質成分分解的有效方法[25]。為了探討堆肥過程DOM的結構和組成變化特征，采用平行因子方法對熒光光譜進行解析。通過殘差分析和折半分析確定堆肥DOM有4個熒光性成分，如圖1所示。根據文獻，推斷C1＼[Em/Ex（nm），410/（240，315）＼]和C3＼[Em/Ex（nm），455/（210，265，365）＼]均為類腐殖質物質，其中C1＼[Em/Ex（nm），410/（240，315）＼]為類富里酸物質[25，26]，C3＼[Em/Ex（nm），455/（210，265，365）＼]為類胡敏酸物質[28]；C2存在肩峰，此肩峰與長短波長下的類腐殖質有關，已有研究表明，色氨酸可與腐殖質結合形成類色氨酸熒光峰[29，30]，因此組分2可能為與類腐殖質物質共存的形態；C4（360/245）為類蛋白物質[30]。

3.2堆肥過程DOM不同分子量熒光組分演變規律

通過超濾的方法將DOM分離成4個不同分子量的組分，基于三維熒光平行因子分析，根據熒光組分得分值Fmax變化，研究DOM在堆肥過程中其結構和組分的變化。圖2表示堆肥過程中熒光組分在不同分子量的分布，基于平行因子分析得到的4個組分在不同分子量DOM的分布差異明顯。

根據三維熒光平行因子分析結果可知，類蛋白物質（組分1）主要存在于堆肥前期的DOM（MW<1kDa）中，隨著堆肥的進行，該熒光物質所占的比重逐漸降低，而類富里酸的熒光組分所占的比重則逐漸增強。在堆肥過程中，類蛋白物質結構簡單，微生物可利用性強，因此在MW<1kDa的DOM的所占的比重逐漸減少直至消失，而類富里酸是具有芳香結構較穩定的組分，同時源于微生物對于木質素的降解，堆肥過程中其在MW<1kDa的DOM中所占的比重穩定增加，在堆肥后期DOM中類富里酸物質是其主要成分。組分2可能為類色氨酸與類腐殖質物質共存的形態，其在堆肥過程中呈波動式增加，組分2的變化也能夠表明堆肥是個腐殖化的過程。C3是類胡敏酸物質，圖2表明類胡敏酸物質穩定存在于MW<1kDa的DOM中，且隨堆肥的進行波動不大。胡敏酸相對分子量在102～107Da之間[31]，故低分子量的胡敏酸能夠存在于分子量<1kDa的DOM中，同時其又是具有醌和酚等芳香性結構的物質[32]，因此其組分在堆肥過程中穩定存在且含量波動不大。

類腐殖質物質（組分1和組分3）是DOM（MW=1～3kDa）、DOM（MW=3～5kDa）和DOM（MW>5kDa）的主要組分，且隨著堆肥的進行其含量增加顯著，分別由堆肥初期的56.8%，65.3%和58.3%演變為堆肥后期的76.5%，74.2%和71.5%。類蛋白物質在這3種不同分子量DOM的含量較低，其在堆肥初期3種不同分子量DOM中分別為12.8%、4.5%和8.7%，在堆肥后期3種分子量組分中其熒光組分完全消失。

3.3不同分子量堆肥DOM的電子轉移能力的演變規律

采用電化學的方法測定堆肥過程中不同分子量DOM的ETC。ETC包含EDC和EAC。圖3表示不同堆肥時期不同分子量DOM的EDC變化。DOM（MW<1kDa）的EDC變化范圍為5.58～11.07μmol/（gC），在堆肥第8d中DOM（MW<1kDa）的EDC最強，隨后隨著堆肥的進行逐漸降低。DOM（MW>5kDa）的EDC變化范圍為7.40～11.39μmol/（gC），雖然在堆肥第28d有波動，但是在整個堆肥過程EDC呈上升的趨勢。堆肥過程中DOM（MW=1～3kDa）的EDC呈先升高后降低的趨勢，堆肥16d的EDC達到最大值（12.38μmol/（gC）），在堆肥40d降到最低（3.78μmol/（gC））。而DOM（MW=3～5kDa）的EDC在堆肥過程無明顯變化規律?？傊?，對于堆肥前期（S1和S2），DOM（MW<1kDa）的EDC比DOM（MW>5kDa）的EDC強，而隨著堆肥的進行不同分子量的DOM的EDC不斷演變，在堆肥后期（S5）則呈相反的趨勢，即DOM（MW>5kDa）的EDC要強于DOM（MW<1kDa）的EDC。

堆肥5個階段不同分子量組分的EAC的變化如圖4所示。DOM（MW<1kDa）的EAC變化范圍為4.51～21.56μmol/（gC），與EDC變化不同，在堆肥過程中DOM（MW<1kDa）的EAC呈逐漸上升的趨勢。DOM（MW>5kDa）的EAC變化范圍為5.45～9.06μmol/（gC），在堆肥過程中波動不大且無明顯規律。同DOM（MW>5kDa）的EAC變化趨勢相同，DOM（MW=1～3kDa）的EAC在堆肥過程中無明顯變化趨勢，但是在堆肥40d的EAC最大（15.78μmol/g（C））。DOM（MW=3～5kDa）的EAC呈先升高后降低后又略微增加的波動式變化趨勢，〖PS07524.eps，Y，PZ#

在堆肥16dDOM達到最大（13.25μmol/g（C）），而在堆肥1dDOM最?。?.89μmol/g（C））。同時對比同一堆肥階段不同分子量的EAC可見，堆肥前期（S1和S2）DOM（MW>5kDa）的EAC強于DOM（MW<1kDa）的EAC，而隨著堆肥的進行，不同分子量DOM的EAC也不斷演變，在堆肥后期（S4和S5）則呈相反的趨勢，即DOM（MW<1kDa）的EAC強于DOM（MW>5kDa）的EAC。

5個堆肥階段不同分子量所有堆肥DOM的EAC和EDC分布如圖5所示，可見EAC的離散程度高于EDC，表明EAC受DOM組成和結構演變的影響程度要高于EDC。通過比較平均值可發現，EDC的平均值要

大于EAC的平均值，但是差距并不明顯。堆肥是有機質的降解和腐殖化過程，在該過程中糖類和蛋白類物質能夠優先被微生物降解，而芳香族結構物質不容易被降解，且源于木質素的降解芳香族物質不斷增加[6，7]。由于堆肥初期含有較多還原性的蛋白質和小分子的氨基酸和糖類[33]，因此具有較高的EDC。同時有機質的EAC主要來源于芳香族化合物[9]，且堆肥后期芳香族化合物不斷生成，因此堆肥EAC受結構演變的影響較大。

3.4DOM的結構和組分演變對ETC的影響

在堆肥過程中不同分子量DOM的EAC和EDC呈現不同的變化規律，為探究這種變化與結構和組成演變之間的關系，對DOM的EAC和EDC與紫外參數和熒光參數做相關性分析，結果如表1所示，EAC與組分2呈現極顯著相關（p<0.01），且與組分1和SUVA270達到顯著相關（p<0.05）。組分2是色氨酸與腐殖質共存的物質。有研究表明，堆肥過程中木質素降解產生芳香碳，芳香碳能夠進一步氧化成醌基，這些醌基與氨基酸交互作用形成類富里酸和類胡敏酸物質[34]，因此這些色氨酸與腐殖質結合形態的物質對DOM的EAC影響顯著。紫外光譜參數SUVA270能夠表示堆肥過程中源于木質素降解的芳香碳的含量[24]，EAC與SUVA270呈顯著相關表明，DOM的EAC與木質素降解產生的芳香碳有關，這與He等[9]報道一致。組分1代表類富里酸物質，前文分析顯示類富里酸物質是堆肥過程變化最顯著的物質且其同樣是具有芳香結構的難降解物質，DOM的EAC與組分1呈現顯著相關，同樣能夠表明DOM的EAC與堆肥過程中的芳香碳的含量有關。所以DOM的EAC與C1、C2和SUVA270呈現顯著相關表明堆肥過程中芳香族化合物對DOM的EAC影響顯著。

與EAC不同，DOM的EDC與熒光參數和紫外參數都無明顯關聯。電子供給能力又可以分為初始電子供給能力（insituEDC）和潛在電子供給能力（PotentialEDC）。初始電子供給能力與樣品提取方式有關，而潛在電子供給能力測量前樣品進行預還原[35]。本研究樣品提取、分離和存儲均暴露于空氣中，故堆肥DOM的EDC僅僅是初始電子供給能力，不能夠代表真實的EDC，故其與熒光參數和紫外參數無明顯關聯，這與文獻＼[17＼]的結論一致。

4結論

采用三維熒光平行因子分析和紫外光譜法研究不同分子量堆肥DOM的結構演變，利用電化學方法測定不同分子量堆肥DOM的ETC，結合相關性分析研究ETC變化的影響因素。研究發現DOM（MW<1kDa）和DOM（MW=1～3kDa）的EDC呈先升高后降低的變化趨勢，而DOM（MW>5kDa）的EDC呈波動式的上升趨勢，DOM（MW=35kDa）的EDC無明顯的變化趨勢。堆肥過程中DOM（MW<1kDa）的EAC持續增加，DOM（MW=1～3kDa）呈先上升后降低而后又略微上升的變化趨勢，對于DOM（MW=3～5kDa）和DOM（MW>5kDa）的EAC則無明顯的變化趨勢。在堆肥初期，DOM的EDC隨分子量的增加呈降低的變化趨勢，其EAC呈增加的變化趨勢，與之相反，堆肥后期DOM的EDC隨分子量的增加呈升高的變化趨勢，其EAC呈降低的變化趨勢。DOM中類富里酸物質、與色氨酸結合的腐殖質物質及SUVA270與EAC呈顯著相關，堆肥DOM的EAC受控于堆肥過程中源于木質素降解芳香碳的含量。通過電化學方法和光譜技術，同時結合數學統計學方法確定影響DOM電子轉移能力演變的主要影響因素，為研究堆肥產品在土壤修復領域的利用提供快捷、科學的途徑。

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AbstractUltrafiltrationtechnologyandspectrumtechnologywereusedtostudythecompositionalandstructuralevolutionofsizefractionateddissolvedorganicmatter（DOM）duringchickenmanurecomposting.Electrochemicalmethodwasusedtomeasureelectrontransfercapacity.TheresultsshowedthatmostofproteinlikecomponentswereexistinDOM（MW<1kDa）anditwasthemaincomponentsinDOM（MW<1kDa）duringinitialcomposting.Theproteinlikecomponentswerepersistentlydegradedandthehumiclikecomponentswerepersistentlygeneratedduringcompostingprocess.Theproteinlikecomponentsdidn′texistinDOM（MW<1kDa）andthefulviclikecomponentswerethemaincomponentsintheendofcompostingprocess.ThehumiclikesubstanceswerethemainfluoresencecomponentsofDOM（MW=1-3kDa，MW=3-5kDa，MW>5kDa）.ThoughthechangesofhumiclikecomponentswithdifferentmolecularweightofDOMweredifferentduringcomposting，thecontentofhumiclikecomponentsintheendofcompostingprocesswashigherthanthatintheinitialcompostingprocess.TheelectrondonatingcapacitywaspersistentlyreducingandelectronacceptingcapacitywaspersistentlyincreasingforDOMwithMW<1kDaintheprocessofcomposting.Incontrast，fortheDOMwithMW>1kDa，theelectrondonatingcapacitywaspersistentlyincreasingandtheelectronacceptingcapacitywasirregularintheprocessofcompostingprocess.Meanwhile，thechangeofelectrontransfercapacitywasirregularforDOMwithMW=1-3kDaandMW=3-5kDa.Inaword，EACofcompostderivedDOMwithsizefractionationwascontrolledbythearomaticcarboncontentwhichwasderivedfromlignindegradation，butnotrelatedtospectrumparameter.

KeywordsComposting；Dissolvedorganicmatter；Molecularweight；Electrontransfercapacity；Parallelfactoranalysis

（Received11October2016；accepted6December2016）

ThisworkwassupportedbytheChinaNationalFundsforDistinguishedYoungScientists（No.51325804）andtheNationalNaturalScienceFoundationofChina（No.51508540）