殼聚糖-磺酸甜菜堿對人肝癌HepG-2細胞的siRNA遞送實驗研究

董 偉，李大玉，惠 景，范 芳，李長福，姜 念，劉 云，朱欣婷

(1.遵義醫學院 貴州省普通高等學校特色藥物腫瘤防治重點實驗室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫學院 生物化學教研室，貴州 遵義 563099)

基礎醫學研究

殼聚糖-磺酸甜菜堿對人肝癌HepG-2細胞的siRNA遞送實驗研究

董 偉1,2，李大玉2，惠 景1,2，范 芳1,2，李長福1,2，姜 念1，劉 云1，朱欣婷1,2

(1.遵義醫學院 貴州省普通高等學校特色藥物腫瘤防治重點實驗室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫學院 生物化學教研室，貴州 遵義 563099)

目的 設計合成新型高分子材料殼聚糖-磺酸甜菜堿(CS-DMAAPS)化合物，并考察該材料與siRNA復凝后對人肝癌HepG-2細胞的轉染能力。方法 采取Michael加成法將含C=C雙鍵的磺酸甜菜堿化合物(DMAAPS)與殼聚糖(CS)偶聯接枝；利用核磁共振氫譜進行結構表征；CCK-8檢測材料的細胞相容性；熒光顯微鏡觀察siRNA的轉染效率；Real-time PCR檢測轉染siRNA后對Bcl-2 mRNA的沉默效率。結果 核磁共振氫譜數據表明：DMAAPS已成功枝接到CS上。熒光顯微鏡觀察結果顯示：質量比(m0/mt：CS-DMAAPS/siRNA)為32、16、8、4、2的復合顆粒分別轉染人肝癌HepG-2細胞24 h后，轉染率分別為33.78%、45.82%、50.98%、69.89%、81.22%。Real-time PCR檢測結果顯示：質量比為4的CS-DMAAPS/siRNA復合顆粒轉染人肝癌HepG-2細胞48 h后，對人肝癌HepG-2細胞的Bcl-2基因沉默效率為26.8%。結論 殼聚糖-磺酸甜菜堿(CS-DMAAPS)化合物能實現siRNA對人肝癌HepG-2細胞的轉染，且細胞相容性良好，能實現目標基因的部分沉默。

殼聚糖；磺酸甜菜堿化合物；復合顆粒；人肝癌HepG-2細胞；siRNA

上世紀60年代，著名分子生物學家Joshua Lederberg認為分子生物學最終的應用將是直接控制人類染色體上的某些核苷酸序列[1]。因此科學家們從上世紀90年代就開始進行基因治療試驗[2-3]，但隨之發生的由于受試者對腺病毒載體的致命免疫反應而導致死亡的“杰辛格事件”[4-5]，以及由于逆轉錄病毒的異常整合誘發患者白血病的惡性事件[6]，人們對病毒性載體的安全性質疑極為強烈。病毒型載體雖然轉染效率高，但它具有諸多缺陷，如毒性大、免疫反應強烈、基因容量小、靶向性差、制備過程復雜等[7]，并且病毒具有一定的致病性，因此安全性成了病毒型載體的致命缺點，并使之臨床應用受到極大限制。因此，研究者將目光投向了非病毒載體的構建上。在眾多非病毒載體材料中，最受人們關注的為殼聚糖這一含氮高分子化合物，其具有低毒性、生物安全性好、易修飾等特性；但由于其基因遞送效率極低，獲得高效率基因表達比較困難[8-11]，嚴重影響其進一步利用。因此，在殼聚糖的基礎上進行改性，賦予其更強的基因遞送能力是該領域的研究熱點之一。

甜菜堿衍生物——N,N-二甲基(丙烯酰胺丙基)丙烷磺酸銨(DMAAPS)是一種兩性鹽，由于內鹽分子內靜電相互作用使其體現出超親水性，兩性鹽改性的材料表現出強烈的抵抗非特異性結合的蛋白吸附、抵抗細菌粘附和生物膜形成的能力，在其作為基因遞送材料進行轉染時，易于形成納米顆粒，并能夠使其在進入細胞內之后免受核酸酶的降解，便于細胞攝取和內涵體逃逸[12]；因此，本研究試圖利用上述甜菜堿衍生物的特性，采用化學偶聯的方法將其與殼聚糖(CS)接枝，以期獲得細胞相容性好，高效遞送siRNA的新型殼聚糖衍生物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 RPMI-1640培養基、胎牛血清，美國Hyclone公司；PBS粉末，生工生物工程(上海)有限公司；N,N-羰基二咪唑(CDI)，上海百靈威公司；N-[(3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺(DMAPPA)、1,3-丙磺酸內酯，上海梯希愛公司；殼聚糖，浙江金殼藥業有限公司；Bcl-2siRNA序列：sense strand,5’-GUGAAGUCAACAUGCCUGC-dTdT-3’; antisense strand,5’-GCAGGCAUGUUGACUUCAC-dTdT-3’參考文獻[13]合成，并標記FAM熒光基團，委托上海吉瑪基因公司合成；Real-time PCR引物：Bcl-2上游5′-GGATTGTGGCCTTCTTTGAG-3′；下游3′-CCAAACTGAGCAGAGTCTTC-5′。GAPDH上游5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′；下游3′-CTTCTGACACCTACCGGGGA-5′，委托生工生物工程(上海)有限公司合成；氘代三氟乙酸(TFA)，美國CIL公司；丙酮、乙酸，成都市科龍化工試劑廠。

1.1.2 肝癌細胞株 人肝癌HepG-2細胞購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

1.1.3 主要儀器 3131型CO2培養箱、Multiskanspectrum全波長酶標儀，美國Thermo公司； NikonYS100熒光顯微鏡，日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 磺酸甜菜堿衍生物(DMAAPS)的制備 稱量4.0 g DMAPPA溶于20 mL無水丙酮中，同時稱取3.0 g 1,3-丙磺酸內酯溶于另20 mL無水丙酮中，待DMAPPA和1,3-丙磺酸內酯完全溶解后，將1,3-丙磺酸內酯在30 min之內逐滴加入到DMAPPA中，并不斷攪拌，在室溫25 ℃環境下反應16 h。反應完畢之后，取反應液離心過濾，得到白色沉淀，用無水丙酮反復清洗沉淀3～4次，最后真空干燥即得DMAAPS[14-16]。

1.2.2 殼聚糖-磺酸甜菜堿化合物(CS-DMAAPS)的合成 取殼聚糖1.0 g溶于1% 醋酸中，待完全溶解后加入0.223 g CDI(N,N-羰基二咪唑)攪拌1 h，分別取0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 g DMAAPS加入到殼聚糖溶液中，在室溫25 ℃環境下攪拌反應24 h，3.5 KD分子量透析48 h，將透析后的液體真空冷凍干燥即得樣品。

1.2.3 CS-DMAAPS的核磁共振氫譜表征檢測 稱取3 mg樣品溶于 600 μL 5%的氘代三氟乙酸(TFA)溶劑中，利用400 MHZ核磁共振儀進行CS-DMAAPS的氫譜檢測。

1.2.4 CS-DMAAPS與人肝癌HepG-2細胞的細胞生物相容性實驗 將處于對數生長期的肝癌HepG-2細胞接種于96孔培基養板中，8×103個細胞/孔，加含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養14 h后棄去培養基，置換新鮮含10 %胎牛血清的RPMI-1640培養基培養，每孔90 μL，設置6個復孔；同時每孔加入10 μL不同濃度的CS-DMAAPS溶液(6.25、12.5、25、50至100 μg/mL)；分別培養12、24、48 h后加入10 μL CCK-8溶液，利用酶標儀在450 nm處檢測其吸光度。

1.2.5 CS-DMAAPS/siRNA復合顆粒的制備 將4 mg CS-DMAAPS溶于40 mL無菌水中，用0.22 μm微孔濾膜過濾，配成100 μg/mL CS-DMAAPS，53 ℃孵育10 min；用50 mmol/L的無菌硫酸鈉溶液將siRNA-FAM分別稀釋成3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL 的濃度，稀釋后分別與CS-DMAAPS等體積混合，間歇渦旋25 s后，在室溫(25 ℃)下靜置30 min，制備出不同濃度的siRNA-FAM的復合顆粒，即質量比(m0/mt)分別為32、16、8、4、2的5個樣本(m0為CS-DMAAPS，mt為siRNA)。

1.2.6 凝膠電泳遷移實驗證明CS-DMAAPS顆粒與siRNA的結合 將CS-DMAAPS配制成1 μg/μL體系，分別取1、2、4、8 μL與2 μL濃度2 μmol/L的siRNA-FAM結合，瓊脂糖凝膠電泳檢測其結合吸附情況。

1.2.7 CS-DMAAPS/siRNA復合顆粒轉染人肝癌HepG-2細胞 將人肝癌HepG-2細胞以4×105個/孔的密度接種于24孔培養板，當細胞融合度達75%左右，吸去每孔培養液，用未加血清的RPMI-1640培養基輕輕潤洗3次，將質量比(m0/mt)32、16、8、4、2的5種CS-DMAAPS/siRNA-FAM復合顆粒分別加至相應培養孔中，每孔100 μL，再用無血清RPMI-1640培養基補足至400 μL。轉染24 h后，在熒光顯微鏡下觀察、拍照、計數，每孔取5個視野，計算出每個視野下的總細胞數和相同視野下熒光細胞數。轉染效率=每個視野下的熒光細胞數/相同視野下的細胞總數×100%。隨后選用m0/mt=8和m0/mt=4的CS-DMAAPS/siRNA-FAM復合顆粒分別轉染人肝癌HepG-2細胞48、72、96 h后，按上述方法計算轉染效率。

1.2.8 Real-time PCR 檢測Bcl-2 mRNA水平的沉默效率 實驗共分為3 組： Control組、CS-DMAAPS 組、CS-DMAAPS/siRNA-FAM實驗組。用m0/mt=4的CS-DMAAPS/siRNA轉染人肝癌HepG-2細胞 48 h后，按RNAiso Plus試劑盒說明書，提取各組細胞總RNA，用Real-time PCR儀檢測(SYBR Green染料法)各組樣品Bcl-2 mRNA 表達量，根據Ct值通過公式2-(△△Ct)進行相對定量分析計算可得Bcl-2 mRNA相對表達量。

2 結果

2.1 CS-DMAAPS高分子材料的核磁共振氫譜 觀察CS(見圖1A)和CS-DMAAPS(見圖1B)的1HNMR(D2O)譜圖，依據各物質官能團特征峰歸屬及峰裂分現象，化學位移δ：2.0～1.8 ppm處有CS中-COCH3，-CH3的特征峰[17]，以此峰作為兩圖中各自的標準峰作積分高度對照；圖1B中δ：3.2～3.3 ppm處有專屬DMAAPS中-N+CH3的微小特征吸收峰[15]；對兩圖化學位移δ特征峰處進行積分比較，B圖中δ：5.92 ppm處有峰且積分面積為1.88，說明CS上已經成功接枝上DMAAPS；且對比A、B圖，B圖中δ：5.5 ppm左右處由高峰變為低峰，峰有裂分現象，由原來的單峰變為多峰亦可說明C-C鍵間-H的增加； A、B圖中δ：3.9 ppm處均有峰且積分面積為1 065.89、31.00，B圖中δ：2.8 ppm處的峰積分面積2.14，在占整個峰積分面積中的比例相對于A圖中δ：2.97 ppm處峰積分面積在占整個峰積分面積中的比例，僅為其比例的4%。受到雜質峰或溶劑峰的影響目標峰有所偏移屬于正?，F象，但這并不影響DMAAPS已成功接枝上CS的判斷，綜上判斷：CS已經成功枝接DMAAPS。

2.2 CS-DMAAPS的細胞相容性評價 不同濃度的CS-DMAAPS作用于人肝癌HepG-2細胞后，在不同的時間點利用CCK-8法檢測各組細胞的存活率；實驗結果如圖2所示：與空白對照組相比(P<0.05)，各CS-DMAAPS濃度組都表現出很低的細胞毒性；且當CS-DMAAPS高達100 μg/mL并作用48 h后，其細胞存活率也在90%左右，由此可見，CS-DMAAPS的細胞相容性很好。

圖1 核磁共振氫譜峰面積積分數據圖CS(A)和CS-DMAAPS(B)

圖2 CS-DMAAPS對人肝癌HepG-2細胞的毒性

2.3 瓊脂糖凝膠電泳證明材料與siRNA的結合 如圖3所示：未經包裹的siRNA-FAM能通過電泳形成明亮的條帶；當CS-DMAAPS與siRNA-FAM的體積混合比例為1∶2和1∶1(v/v)時，siRNA條帶亮度明顯降低；當材料與siRNA-FAM濃度比例為2∶1和4∶1(v/v)時siRNA條帶基本消失；該現象說明CS-DMAAPS能通過表面-NH2和季銨正離子基團所攜帶的正電荷能將siRNA-FAM吸附住，并且經瓊脂糖電泳也很難將siRNA從CS-DMAAPS上脫離開來；該現象說明CS-DMAAPS能與siRNA有效結合。

圖3 CS-DMAAPS/siRNA復合物的凝膠阻滯電泳

2.4 檢測CS-DMAAPS/siRNA-復合顆粒轉染人肝癌HepG-2細胞的轉染效率

2.4.1 不同濃度的CS-DMAAPS/siRNA轉染人肝癌HepG-2細胞的轉染效率 質量比(m0/mt)為32，16，8，4，2的CS-DMAAPS/siRNA復合顆粒分別轉染人肝癌HepG-2細胞24 h后，轉染效率分別為33.8%、45.8%、51.0%、69.9%、81.2%，呈現明顯的劑量依賴性(見圖4)。另外，熒光顯微鏡成像情況表明，攜有FAM的復合顆粒轉染人肝癌HepG-2細胞后能夠很容易進入胞內(見圖5)。

圖4 CS-DMAAPS/siRNA轉染人肝癌HepG-2細胞的效率

A:m0/mt=0; B:m0/mt= 8; C:m0/mt=4; 熒光光源(A,B,C); 明場(A1,B1,C1); 明場+熒光光源(A2,B2,C2)。
圖5 CS-DMAAPS/siRNA轉染后熒光顯微鏡成像情況(×100)

2.4.2 轉染時間對轉染效率的影響 選用m0/mt=8和m0/mt=4的CS-DMAAPS/siRNA復合顆粒分別觀察轉染后48、72和96 h 3個時間點的轉染效率。如圖6顯示，隨著轉染后持續時間的延長，其轉染效率在下降。

圖6 轉染時間對CS-DMAAPS/siRNA的轉染效率的影響

2.5 Real-time PCR檢測Bcl-2 mRNA水平的沉默效率 由圖7可見，將m0/mt=4的CS-DMAAPS/siRNA轉染人肝癌HepG-2細胞48 h后，Bcl-2 mRNA的表達量減少(P<0.05)，且Bcl-2 mRNA 水平的沉默效率為26.8%。

n=3，*：P<0.05。 圖7 RT-PCR CS-DMAAPS/siRNA對Bcl-2基因表達的影響

3 討論

目前，基因治療載體系統主要包括兩類：病毒載體和非病毒載體，兩者在使用中都具有局限性。已知的病毒載體雖然轉染效率高，但容易引起病毒野生型突變、免疫反應、潛在致癌性等[7]；非病毒載體雖難有高效率表達[8]，但卻有病毒載體無法比擬的優點：如易降解，安全性較高且來源廣泛。

非病毒載體中的殼聚糖(CS)具有高陽離子電勢和較低的細胞毒性，是一種具有良好細胞相容性和生物降解性的天然高分子材料[18]。但是，CS的低轉染率極大限制了其在基因遞送中的應用[19]。既往研究表明，殼聚糖及其衍生物作為非病毒載體被廣泛用于基因遞送，殼聚糖-聚乙烯亞胺顆粒[20-23]是眾多研究中報道最多的。隨后，又報道了眾多殼聚糖衍生物，如殼聚糖-三聚磷酸鹽納米顆粒[24-25]、聚乙烯亞胺-羧甲基殼聚糖聚合物[26]、殼聚糖-磷酰膽堿和大環多胺[27]、殼聚糖-聚L-精氨酸顆粒[28]、殼聚糖-硫胺素焦磷酸鹽[29]、季銨鹽化的殼聚糖[30]等，這些殼聚糖衍生物在保留了殼聚糖的低細胞毒性、高生物相容性的基礎上，還具有殼聚糖無法比擬的高轉染效率。分析這些殼聚糖衍生物，可發現它們具有一個共同點：殼聚糖接枝的化合物都含有氮元素，這為新型殼聚糖衍生物基因遞送材料的合成提供了參考。

甜菜堿衍生物——N,N-二甲基(丙烯酰胺丙基)丙烷磺酸銨(DMAAPS)作為基因遞送材料進行轉染時，易于形成納米顆粒，并能夠使其在進入細胞內之后免受核酸酶的降解，便于細胞攝取和內涵體逃逸[12]。另有研究顯示，高濃度的DMAAPS對許多酶及其他生物大分子的構象不但沒有影響，甚至有一定保護作用[31-32]。此外，有研究報道了PEI枝接DMAAPS后具有良好的轉染效率、低細胞毒性等優點[13-14]。受此啟發，本實驗在CS基礎上成功枝接DMAAPS合成了一種新的基因遞送材料。實驗結果表明，質量比(m0/mt：CS-DMAAPS/ siRNA)為32、16、8、4、2的復合顆粒轉染人肝癌HepG-2細胞24 h后，轉染效率分別為33.78%、45.82%、50.98%、69.89%、81.22%。m0/mt=4的CS-DMAAPS/siRNA復合顆粒轉染肝癌HepG-2細胞48 h后，對HepG-2的Bcl-2基因沉默效率為26.8%。

本實驗首次將CS和DMAAPS枝連，將其作為基因遞送材料轉染人肝癌HepG-2細胞時，能夠有效裝載siRNA并通過細胞膜實現遞送，表現出較高的轉染效率且保持了良好的細胞相容性、低細胞毒性的優點，最終實現基因沉默。研究結果表明殼聚糖-磺酸基甜菜堿(CS-DMAAPS)化合物在遞送siRNA方面具有潛在的應用價值。

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[收稿2016-12-10;修回2017-01-22]

(編輯：王靜)

Research on siRNA delivery mediated by chitosan-culfobetaine on human hepatoma HepG-2 cells

DongWei1,2,LiDayu2,HuiJing1,2,FanFang1,2,LiChangfu1,2,JiangNian1,LiuYun1,ZhuXinting1,2

(1.Guizhou Provincial College-Based Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Department of Biochemistry and Molecular Biology,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective The aim of this study is to synthesize the chitosan-sulfobetaine (CS-DMAAPS) copolymer as siRNA delivery vector,and investigate the transfection efficiency on HepG-2 cells.Methods The sulfonic acid betaine (DMAAPS) with C=C was grafted onto chitosan (CS) by Michael addition method,and the structure of the copolymer was characterized with1H-NMR.The cytocompatibility of CS-DMAAPS was examined through CCK-8 method.The transfection efficiency of CS-DMAAPS was observed with fluorescence microscopy.And the silencing efficiency ofBcl-2 gene expression was detected after siRNA gene transfection.Results NMR data showed that DMAAPS had been successfully connected to CS.The transfection efficiencies of the copolymers with different CS-DMAAPS/siRNA mass ratio (m0/mt:32,16,8,4 and 2) were not same.They were 33.78%,45.82%,50.98%,69.89% and 81.22%,respectively.Real-time PCR results showed that the silencing efficiency ofBcl-2 gene expression in HepG-2 cells was 26.8% after transfection by using nanoparticles (m0/mt:4).Conclusion CS-DMAAPS could be a feasible new gene delivery material with good biocompatibility,which could delivery siRNA into HepG-2 to inhibit the expression ofBcl-2 gene.

chitosan; sulfobetaine compound; complex particles; hepatocellular carcinoma cells HepG-2; siRNA

貴州省科技廳社會發展攻關項目(NO：黔科合SY[2013]3008); 遵義醫學院招標項目(NO：F-614)；貴州省教育廳特色重點實驗室建設項目(NO：黔教合KY字[2014]212)。

朱欣婷, 女，碩士，副教授，研究方向：小分子抗癌藥物研究與開發，E-mail:xintingzhu@126.com。

R735.7

A

1000-2715(2017)01-0042-07