黃花蒿離體再生體系優化研究

楊正修+張學文+羅莎+龍炎杏+趙燕

摘要：為優化黃花蒿（Artemisia annua Linn）離體再生體系，并建立黃花蒿遺傳轉化途徑，選用黃花蒿常規品種428-A為材料，以子葉、幼嫩葉片、頂芽作為外植體，設計不同植物生長調節劑組合的培養基配方。結果表明，黃花蒿子葉適宜作為組織培養的外植體，MS+1.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA培養基有利于誘導愈傷組織形成和分化，其出愈率及出芽率分別高達89.0%、85.7%，1/2MS+0.05 mg/L NAA+0.05 mg/L IAA培養基有利于再生植株不定根的誘導，生根誘導率達94.0%。

關鍵詞：黃花蒿（Artemisia annua Linn）；外植體；子葉；植株再生體

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）06-1161-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.06.042

Abstract： In order to optimize Artemisia annua Linn in vitro regeneration system and establish transformation way，the conventional varieties 428-A of Artemisia annua Linn as material was chose. Cotyledon，young leaves， crown were used as explant，the simple and effective regeneration system of Artemisia annua Linn was set up，by using different types and different concentrations of plant growth regulator of the formula. The results indicated that the young leaves is the best material for the tissue culture of explant. The best solid medium of callus formation and differentiation is MS+1.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，the rate of callus formation is 89.0% and the rate of budding is 85.7%. The most useful solid medium of inducing of root is 1/2MS+0.05 mg/L NAA+0.05 mg/L IAA， in which the rooting rate reached 94.0%.

Key words： Artemisia annua Linn； explants； young leaves； vitro

黃花蒿（Artemisia annua Linn）為一年生艾屬菊科草本植物，在中國已經有兩千多年的藥用歷史[1]。從黃花蒿中分離出的活性單體成分青蒿素（Artemisinin），被證明是一種高效、低毒、副作用小的新型抗瘧活性成分，已廣泛應用于臨床[2]。同時青蒿素及其衍生物在抗腫瘤、抗心血管疾病、鎮痛、免疫、抗血吸蟲、抗病原蟲等方面也具有顯著療效[3]。

黃花蒿在世界范圍內分布廣泛，產地環境條件差異大，青蒿素含量變化也十分明顯[4]。在中國，青蒿中青蒿素的含量從南到北基本呈遞減趨勢，其提取成本高，導致青蒿素價格居高不下，難以滿足市場需要[5]。近年來，人們嘗試從組織培養及擴繁技術獲得的黃花蒿中分離青蒿素，單位產量黃花蒿中分離的青蒿素含量高于野生黃花蒿[6]。通過植物組織培養技術進行離體快繁，不僅可為生產上提供大量黃花蒿試管苗，推動優質黃花蒿生產的發展，而且可使其成為提高青蒿素產量的重要途徑[7]。

近年來，在黃花蒿的組織培養方面，目前已通過其葉片、莖尖、莖段、花序等多種外植體誘導愈傷及再生植株，但不同生長調節劑種類和組合，在不同基因型黃花蒿品種上應用差別較大，結果不盡一致[8]，其組培過程中的玻璃化現象也較嚴重[9]。本試驗分別以子葉、葉片、頂芽作為外植體，在不同組織培養階段添加不同種類和不同濃度的植物生長調節劑以優化培養基配方，建立簡單有效的再生體系，為黃花蒿的遺傳轉化和優良種質的保存及改良提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

黃花蒿種子為常規品種428-A，湖南農業大學生物科學技術學院朱衛平副教授惠贈。

1.2 培養基

1）基本培養基：MS+3%蔗糖+7%瓊脂，pH 5.8。

2）愈傷組織誘導及分化培養基：以MS為基本培養基，設置NAA、6-BA、KT 3種植物生長調節劑的不同濃度組合，進行愈傷的誘導、增殖及不定芽分化培養。

3）不定芽生根培養基：以1/2MS培養基為基礎，設置NAA、IAA的不同濃度組合誘導生根。

1.3 外植體的獲得

1）將脫脂棉浸透MS液體培養基與培養皿一起經高壓蒸汽滅菌備用。將黃花蒿種子放入離心管中，加入1 mL 0.1%HgCl2溶液，快速混勻、懸浮，6 000 r/min離心2 min，無菌條件下吸出升汞，再用無菌水清洗5～6次，然后將種子均勻鋪到放有脫脂棉的無菌培養皿中，置于28 ℃恒溫培養箱培養，使其發芽獲得無菌苗。在黃花蒿幼苗生長的不同時間取發育良好的子葉、葉片和頂芽分別作為外植體接種到不同濃度配比的植物生長調節劑培養基上。

2）直接將種子播種在腐殖土∶蛭石（3∶1）的營養土上，3～4 d即可萌發，分別取長出子葉或葉片的健壯植株放入0.1%的HgCl2溶液中消毒10 min，切下子葉、葉片和頂芽作為外植體。

1.4 外植體的接種

將消毒的外植體接種于不同的培養基中，誘導愈傷的形成及分化，記錄并統計出愈數、芽分化數；再將分化生長的無根苗接種在不同生根培養基中。培養條件為每日光照10～12 h，光照度為1 500～2 000 lx，溫度（25±2） ℃。

1.5 數據分析

數據處理采用SPSS軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 外植體的獲得

采用無菌苗和實生苗為外植體，分別于子葉期、幼苗期取材接種，兩種來源的外植體中，無菌苗所取外植體，在后期培養時不易染菌，感染率較低，但種子無菌發芽時萌發較晚，且植株較自然條件下生長勢偏弱，在后期誘導分化過程中生活力偏低。自然條件下發芽的實生苗植株較健壯，生長發育快，6～7 d子葉展開，7～14 d，幼苗長出兩片羽狀葉片，20 d后，幼苗部分葉片生長到2～3 cm時即可進行葉片外植體接種。由于實生苗生長健壯，取材方便，更適合大批量接種，但接種時應盡量減少感染。

2.2 植物生長調節劑對誘導愈傷組織形成和分化的影響

黃花蒿愈傷組織形成、芽分化、生根及試管苗如圖1所示。

由表1可以看出，4～12號培養基均能誘導黃花蒿的子葉、葉片或頂芽等外植體形成愈傷組織，而1～3號、13～15號培養基外植體均未誘導出愈傷。通過對1～3號培養基與4～6號培養基比較可以表明，NAA對誘導愈傷組織的形成是必要的，1.0～2.0 mg/L 6-BA均能誘導愈傷組織，且當6-BA達到3 mg/L時易引起組織玻璃化，而1.5 mg/L 6-BA的濃度較為合適。

而在5、7、8、9號培養基中，1.5 mg/L 6-BA、0.05 mg/L NAA時，其誘導率和分化效率最佳。其中4、5、6號培養基的愈傷誘導率較高，且形成的愈傷色澤淺綠、結構致密，生長速度快，分生能力強，為典型的Ⅰ型愈傷組織。

對4～12號培養基研究表明，在黃花蒿的愈傷組織誘導中NAA和KT都是必需的植物生長調節物質，NAA比KT更能高效地誘導愈傷組織的形成和分化。通過對1-3號培養基單獨添加6-BA的培養基和13～15號培養基同時添加6-BA、KT、NAA的培養基比較發現：外植體可以從器官型途徑直接分化出芽，其中1～3號培養基出芽率偏低，叢芽生長緩慢，且當6-BA達到3 mg/L時易引起組織玻璃化。在13～15號培養基中，雖出芽率較1～3號培養基高，但總體效率較4～6號培養基低，雖然4～7號培養基要經過短暫愈傷才分化出芽，但其出愈時間快，且剛出愈后便迅速分化出叢芽，分化率高、時間短，而13～15號培養基雖直接出芽但其分化時間長，叢芽生命力差，生長緩慢。綜上所述，5號培養基是誘導愈傷和分化不定芽的合適培養基。

SPSS單因素方差分析表明，本試驗的P<0.001，差異極顯著，說明由于培養基中生長調節劑不同造成的分生芽數量差異有統計學意義，生長調節劑種類和濃度能夠極顯著影響不定芽的產生和分化。

2.3 外植體對愈傷組織誘導的影響

分別以黃花蒿實生苗子葉、葉片、頂芽等作為外植體誘導分化，結果見表2～表4。子葉、葉片、頂芽均能誘導愈傷，其5號培養基誘導率均高于其他培養基，其中以子葉為外植體誘導率達最高到94%，出愈時間為最短（11 d），以羽狀葉片為外植體誘導愈傷時，愈傷啟動后葉片容易出現黃化且誘導時間較長，以頂芽為外植體誘導愈傷，雖然誘導率與子葉的誘導效果相差不大，但誘導時間比子葉平均長3.5 d，且接種過程中易造成感染，愈傷增值后容易褐化，不定芽分化率偏低。3種外植體中，子葉誘導的胚性愈傷組織，誘導時間短，效率高，后期的分化及出苗率均高于以葉片、頂芽誘導的愈傷。結果表明，在該基因型的黃花蒿子葉較適合作為外植體。

2.4 幼苗的生根

以1/2MS培養基為基礎，設置NAA，IAA的不同濃度組合誘導生根，結果如表5所示。由表5可知，4種培養基都可誘導黃花蒿不定根的生成，只是生根時間和數量有差異。其中4號培養基，即1/2MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IAA為生根較佳培養基，生根率高且根粗壯。當將幼苗接種于此培養基中時，第8天便有根出現，再過4～5 d不定根的數量增多，根系增長且粗壯。1號培養基，即1/2MS+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L IAA不定根的誘導效率偏低，可能是由于生長素濃度的降低，影響了根尖分生組織的分裂進而影響了生根效果。

SPSS單因素方差分析表明，試驗中P<0.001，具有極顯著性差異，說明植物生長物質種類和濃度的不同對幼苗生根的影響有統計學意義，是影響生根效率的重要因素。

3 討論

3.1 植物生長調節劑的影響

在培養基中添加外源性植物生長調節劑時細胞分裂素與生長素的比例十分重要，是誘導愈傷組織的形成、分化以及正常分化成苗的關鍵因素，合適的植物生長調節劑濃度的選擇有利于建立優化的再生體系，為后續的遺傳轉化研究提供基礎。賈秀山等[10]認為誘導黃花蒿愈傷組織形成的最佳培養基配方為MS+2.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L KT；誘導黃花蒿愈傷組織分化的最佳培養基配方為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA。而本研究中發現，誘導黃花蒿愈傷形成的植物生長調節劑配比也剛好適用于不定芽的分化，因此愈傷誘導和不定芽分化可以同步進行，期間不需頻繁更換培養基，這樣可以大大縮短組培苗的時間，提高快繁效率，適應較大規模的試管苗繁殖。同時，黃花蒿愈傷誘導和不定芽分化同步進行的發育模式也為黃花蒿的遺傳轉化體系提供了簡單方便的分化途徑。唐鳳鸞等[11]利用加入6-BA和IBA的培養基誘導黃花蒿生芽，張麗珍等[12]利用6-BA+IBA的培養基誘導葉片出愈及分化。而本研究則利用6-BA與NAA的組合培養基誘導愈傷及分化出芽，且分化效率較高，其結果豐富并優化了黃花蒿快繁體系的生長調節劑種類。于飛飛等[13]認為外植體在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培養基上誘導叢生芽效果最好，這與本試驗結果有差異，分析原因可能與不同基因型的黃花蒿品種內源激素差異有關。王夢瓊等[6]利用6-BA與KT的組合對黃花蒿葉片、花序進行芽的誘導，誘導結果不佳，本研究用其組合誘導子葉出芽，其誘導效果同樣不理想。說明KT在黃花蒿外植體出芽誘導中作用可能不大。

3.2 外植體的影響

黃花蒿組織培養的研究主要集中在誘導分化的方式與外植體的選擇上。不同外植體的分化難易程度各不相同，這與外植體的生長情況、生理生化特性等緊密相關。趙欣等[14]利用MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA的培養基組合以青蒿的根、莖、葉片作為外植體誘導愈傷組織，其誘導效率以根為最佳，莖和葉片次之。楊耀文等[15]利用黃花蒿幼嫩的花序，莖段誘導愈傷組織的形成分化，發現花序的增殖率是莖段的2～3倍。賈秀山等[10]分別對葉片、帶腋芽的花序、和莖段進行誘導分化，其中葉片誘導愈傷出愈率較低，但后期愈傷組織的分化率、出苗率都很高，帶腋芽的莖段誘導愈傷組織形成最快，但分化率較低，易褐變，花序基本不形成肉眼可見的愈傷組織，而是直接形成幼苗。王夢瓊等[16]以黃花蒿花序為外植體分別進行愈傷組織誘導及芽和根的分化，結果黃花蒿愈傷組織誘導率為100%，芽分化率為100%，根的分化率可達85%。本研究中以葉片為外植體的誘導結果與上述研究結果有相似之處，采用頂芽為外植體其誘導、分化效率與伍曉麗等[17]，張偉華[18]報道的一致。但以子葉作為外植體誘導愈傷和叢芽時，發現子葉的誘導效率更優于葉片和頂芽，且取材方便、實用，該結果可為黃花蒿快繁體系的優化，建立黃花蒿遺傳轉化體系提供有效途徑。

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